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他克莫司(FK506)是链霉菌生产的一种23元大环内酯类免疫抑制剂,在临床上用于治疗肝脏、肾脏、胰腺和心脏等器官移植后排斥反应。我们以他克莫司工业生产菌株——筑波链霉菌L19为研究对象,其生物合成基因簇中包含两个调控基因fkbN和tcs7。首先,我们利用逆转录PCR对他克莫司合成基因簇进行转录单元分析,确定了其中含有8个转录单元：tcsA-tcsB-tcsC-tcsD；tcs1；tcs2-tcs3-tcs4-tcs5；fkbG； fkbB-fkbC-fkbL-fkbK-fkbJ-fkbI-fkbH;fkbO-fkbP-fkbA-fkbD-fkbM;tcs6-fkbQ-fkbN； tcs7。在筑波链霉菌L19中过表达fkbN和tcs7将他克莫司的产量分别提高了76%和40%,表明FkbN和Tcs7均是他克莫司合成基因簇内的正调控因子。荧光定量PCR比较野生株L19和fkbN过表达菌株L21的转录水平发现,包括调控基因tcs7在内的目的基因转录水平都得到显著增强。FkbN属于LAL家族,比对显示FkbN可能具有ATPase活性并受到ATP的调节。异源表达纯化FkbN-DBD进行EMSA反应,发现FkbN-DBD结合在四个启动子区：tcaAp、fkbGp、 fkbB-fkbQ间隔区、cs6-tcs7间隔区。DNase I footprinting确认了与FkbN-DBD结合的启动子序列具有特异性,为10 bp左右的反向互补保守序列。这四个启动子区控制着他克莫司生物合成中PKS/NRPS基因、特殊前体合成基因、调控基因tcs7等的转录,表明FkbN通过激活这些基因的转录提高了他克莫司的产量。另一个调控因子Tcs7是LysR家族调控蛋白,我们生物信息学比对分析了包括Tcs7在内的10种LysR蛋白,发现这些蛋白具有35.3%序列相似性,结合LysR家族蛋白的结构与功能之间的关系,我们推测Tcs7可能具有自调控功能。荧光定量PCR比较野生株L19和tcs7过表达菌株L22的转录水平,发现包括fkbN在内的目的基因表达量均有上调。将Tcs7的DNA结合结构域进行异源表达纯化,EMSA实验结果显示Tcs7-DBD只能结合在tcs6-tcs7间隔区,该间隔区存在两个启动子分别控制tcs7和tcs6-fkbQ-fkbN的转录,表明Tcs7可能直接正调控fkbN从而提高他克莫司产量。基于以上结果,我们对他克莫司的途径特异性调控通路进行重组,构建了fkbN和tcs7的双过表达菌株L23,将他克莫司的产量提高了89.3%。综上所述,我们揭示了他克莫司生物合成的途径特异性调控机制：FkbN正调控tcs7和他克莫司合成基因、前体基因、修饰基因的转录,这种调控可能还受到ATP的激活；Tcs7也能正调控fkbN的转录,形成自我放大的调控循环,这种循环可能会因为Tcs7抑制自身转录和他克莫司积累产生的细胞毒性等受到限制,从而维持他克莫司生物合成的平衡。