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研究基础:本课题组前期研究结果发现,雌激素受体拮抗剂他莫昔芬对人子宫内膜样癌中分化JEC细胞有促增殖作用,氟维司群能抑制JEC细胞增殖;而雌二醇分别与他莫昔芬、氟维司群联用对JEC细胞仍有促增殖作用。p57kip2基因外显子无突变,P57kip2在JEC细胞中的异常表达与p57kip2基因启动子区DNA高甲基化有关。目的:本研究将分别从体外进一步探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidin e,5-Aza-CdR）干预后雌激素受体拮抗剂他莫昔芬（Tamoxifen,TAM）、氟维司群（ICI-182780,ICI）对JEC细胞增殖、形态改变及P57kip2、Cyclin D1蛋白表达情况的影响;从体内探讨5-Aza-CdR作用后JEC细胞裸鼠移植瘤生长及其P57kip2、Cyclin D1蛋白的表达情况,初步探索5-Aza-CdR作用于JEC细胞裸鼠移植瘤的抗肿瘤效应。方法:1、无5-Aza-CdR干预时ER拮抗剂对JEC细胞的增殖活性的影响将JEC细胞分成对照组、雌二醇（β-estradiol,E2）组、TAM组、ICI组、E2+TAM组、E2+ICI组,用甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测培养24h、48h、72h时各组细胞的增殖活性。2、5-Aza-CdR干预对JEC细胞的影响（1）检测5-Aza-CdR干预后JEC细胞中p57kip2启动子区甲基化率用5-Aza-CdR处理JEC细胞后,亚硫酸氢盐测序（Bisulfite sequencing PC R,BSP）法检测细胞中p57kip2启动子区的总体甲基化率。（2）检测5-Aza-CdR干预后ER拮抗剂对JEC细胞生长及其P57kip2、Cyclin D1蛋白表达的影响实验分组同上述方法一中无5-Aza-CdR干预时的分组,用MTT法检测5-Aza-CdR干预后培养24h、48h、72h时各组细胞的增殖活性;光镜和电镜下观察5-Aza-CdR干预后培养72h时各组细胞的形态改变,用蛋白印迹（Western blot）法检测5-Aza-CdR干预后培养72h时各组细胞中P57kip2、Cyclin D1蛋白的相对表达水平。3、5-Aza-CdR作用后JEC细胞裸鼠移植瘤中P57kip2、Cyclin D1蛋白表达情况（1）JEC细胞裸鼠移植瘤造模:选雌性裸鼠（4周龄）15只,将JEC活细胞悬液（浓度1×10~8个/ml）以0.2m/只的剂量皮下注射在裸鼠左侧腋窝。将造模成功的裸鼠随机分为对照组、实验组（A组、B组）,每组5只,用剂量为1.6μg/g的5-Aza-CdR腹腔注射实验组（A组为低剂量持续给药组:每2天给药一次,共计5次;B组为短时间内多次给药组:仅第一天连续给药3次,每次间隔0.5h,之后不再给药）;对照组给予等量生理盐水腹腔注射。（2）检测裸鼠移植瘤相关指标:（1）整个给药期间,每2天测量一次各组裸鼠体重及移植瘤的长径（a）、短径（b）,绘制移植瘤生长曲线图。（2）10天后将所有裸鼠移植瘤全部取材:Ⅰ、光镜观察瘤块的组织学形态特征;Ⅱ、免疫组织化学染色En Vision法分别检测移植瘤中P57kip2、Cyclin D1的表达情况。结果:1、无5-Aza-CdR干预时ER拮抗剂对JEC细胞的增殖活性的影响无5-Aza-CdR干预时,与对照组相比,E2组、TAM、E2+TAM组、E2+ICI组细胞增殖活性升高;ICI组增殖活性降低。2、5-Aza-CdR干预对JEC细胞的影响（1）BSP法检测结果:5-Aza-CdR干预24h后,JEC细胞p57kip2启动子区甲基化率从81.1%下降至76.2%。（2）5-Aza-CdR干预后ER拮抗剂对JEC细胞生长及其P57kip2、Cyclin D1蛋白表达影响:（1）MTT检测结果:5-Aza-CdR干预后,与对照组相比,E2组的细胞增殖活性在24h、48h、72h均升高;ICI组、E2+TAM组、E2+ICI组在各时间段的细胞增殖活性均下降。且5-Aza-CdR干预后的各组与干预前相比较,细胞增殖活性均呈现下降趋势（P＜0.05）。（2）光镜、电镜下观察JEC细胞的形态改变:5-Aza-CdR干预后,对照组细胞呈圆形或类圆形,细胞游离缘可见少量微绒毛;与对照组相比,E2组细胞密度最高,实验组中以E2+TAM组密度最低;E2+TA M组分泌泡数量最多,且在TAM组、E2+ICI组中见凋亡小体。（3）Western blot检测结果:5-Aza-CdR干预后,与对照组相比,P57kip2蛋白在E2组中表达下调;在ICI组、E2+TAM组、E2+ICI组中表达均升高;Cyclin D1蛋白在E2组中表达升高,在TAM组、ICI组、E2+TAM组、E2+ICI组中表达量均降低（P＜0.05）。相关性分析结果显示,JEC细胞中Cyclin D1蛋白表达与P57kip2蛋白表达呈负相关:P57kip2蛋白表达升高,而Cyclin D1蛋白表达下调。3、5-Aza-CdR干预对JEC细胞裸鼠移植瘤中P57kip2、Cyclin D1蛋白表达影响（1）裸鼠体重及移植瘤生长情况:A组于第3次给药后出现体重下降趋势,体重低于对照组、B组（P＜0.05）;与对照组相比,实验组移植瘤生长均呈现相对缓慢趋势,仅A组结果有统计学意义。（2）移植瘤相关指标检测:光镜下可见肿瘤组织呈实性巢团、结节样生长,间质可见促结缔组织增生,肿瘤细胞极性消失、排列拥挤,核大深染、有异型性、核仁明显,有凋亡及病理核分裂像,其中A、B组中可见片状坏死。（3）5-Aza-CdR干预后JEC细胞裸鼠移植瘤中P57kip2、Cyclin D1的表达情况:A组、B组Ki-67增殖指数略低于对照组;P57kip2蛋白在A组、B组中的阳性表达率略高于对照组;Cyclin D1蛋白在A组、B组中的阳性表达率略低于对照组（P＜0.05）。结论:1、5-Aza-CdR可下调JEC细胞p57kip2基因启动子高甲基化水平,上调P57kip2蛋白的表达,恢复p57kip2基因的抑癌活性,降低TAM对JEC细胞的雌激素样作用,增强ICI对JEC细胞增殖的抑制作用。2、5-Aza-CdR还可能与TAM、ICI协同上调P57kip2蛋白的表达,降低Cyclin D1蛋白的表达,负向调控细胞周期,抑制JEC细胞生长。3、低剂量5-Aza-CdR持续作用JEC细胞裸鼠移植瘤,可上调移植瘤中P57kip2蛋白表达,下调Cyclin D1蛋白表达水平,阻碍细胞周期进程,抑制移植瘤生长。