论文部分内容阅读
第一部分柯萨奇B3病毒性心肌炎小鼠循环血及心肌内端粒酶和干细胞的时空变化的研究
目的: 病毒性心肌炎引起的心肌损伤作用机制并未完全清楚。本研究通过柯萨奇B3病毒性心肌炎实验模型,观察柯萨奇B3病毒感染对循环血及心肌内端粒酶活性及TERT和干细胞变化情况,进一步探讨在病毒性心肌炎端粒酶及TERT和干细胞可能作用机制。
方法: 小鼠随机接受病毒培养基(对照组,CON组)或病毒液(病毒组,VIR组)注射。随后,动物根据以下几时间点进一步分为六小组:注射后1天、3天、7天、14天、21天和28天。每小组取10只小鼠作观察。从动物眼球取血分离得到循环血单个核细胞,应用流式细胞仪分析其干细胞标记、TaqMan实时定量RT-PCR、免疫印迹技术和TRAP-ELISA法分别用来测定心肌内端粒酶逆转录酶(TERT)mRNA和蛋白水平变化以及端粒酶活性变化情况。利用H&E染色、组织化学免疫染色技术观察心肌炎症反应、干细胞标记物及粒细胞过氧化酶(MPO)和活性氧(ROS)变化。
结果:
1. MPO和ROS含量于感染后3天达高峰,感染后28天,基本回到正常水平。CON组与NOR组之间,MPO和ROS含量无显著性差异。
2. 与正常组比较,对照组各时段小鼠循环血CD44+CD106+干细胞(间充质干细胞标记物)和Sca-1+CD45+干细胞(造血干细胞)无显著性差异。而病毒组,循环血CD44+CD106+间充质干细胞含量于感染后3天达高峰,7天下降,而于14天基本恢复正常水平。同时,循环血Sca-1+CD45+造血干细胞含量于感染后1天开始增加,并持续至感染后14天。
3. 心脏中Sca-1抗体染色阳性细胞数于感染后3天明显增加,7天达高峰,14天仍保持不变,而28天明显减少。各对照组之间局部心脏干细胞数量无明显变化。
4. 与NOR组和CON组比较,病毒组小鼠端粒酶表达明显下降。病毒组TERT mRNA表达水平和蛋白表达水平于感染后7天和14天明显增高,于21天下降。端粒活性也在感染后7天和14天明显增高。而NOR组和CON组各时段TERT表达水平和端粒酶活性无显著性改变。
结论: 本研究结果表明病毒性心肌炎小鼠中干细胞和端粒酶活性及TERT表达呈明显时相性变化,提示在心肌损伤的病理状态下,通过提高干细胞和端粒酶活性及TERT表达可能促进受损心肌细胞再生与修复。并且病毒感染后2周及时细胞移植是实施心脏修复的最佳时机。
第二部分黄芪甲甙对病毒性心肌炎心肌端粒酶作用的研究
目的:观察黄芪甲甙不同剂量干预后对病毒性心肌炎小鼠端粒酶活性及其逆转录酶(TERT)的表达的影响,进一步探讨其治疗病毒性心肌炎的药理作用机制。
方法:Balb/c雄性4 周龄小鼠54 只,随机分为5 组:A组(正常空白对照组,腹腔接种0.1ml病毒培养液+0.1ml羟甲基纤维素钠盐溶液灌胃2 周,每日1 次,n=10),B组(正常黄芪对照组,腹腔接种病毒培养液+0.1ml 9%黄芪甲甙灌胃2周,每日1 次,n=10),C组(高剂量黄芪治疗组,腹腔接种同剂量CVB3+0.1ml 9%黄芪甲甙灌胃,n=10),D组(低剂量黄芪治疗组,腹腔接种同剂量CVB3+0.1ml 1%黄芪甲甙灌胃,n=10),E组(模型组,腹腔接种同剂量CVB3+羟甲基纤维素溶液灌胃,n=14)。观察14d后,眼球采血后处死动物,摘取心脏组织。分析各组小鼠的死亡率;用TRAP-ELISA法检测外周血单个核细胞端粒酶活性;RT-PCR技术检测心肌细胞TERT表达。
结果: A 组,B组,C组,D组,E 组的小鼠死亡率分别为0%、0%、10%、30%和50%,C 组死亡率明显低于D 组和E 组,后2 组之间无显著差异。
TRAP-ELISA 结果显示,A组、B组和C组外周血单个核细胞端粒酶活性均呈阳性,三者之间无显著差异,而D 组和E 组均为阴性。RT-PCR 结果表明,C组TERT 表达明显高于D组和E组,与A组和B组无显著差异,而D 组与E 组之间无显著差异,A 组和B 组之间也无显著差异。
结论:本实验结果表明病毒性心肌炎小鼠外周血单个核细胞端粒酶活性下降,心肌细胞端粒酶催化亚基TERT 表达水平减低;进行黄芪甲甙干预后,端粒酶活性增强,TERT 表达水平明显升高,提示黄芪甲甙可通过增强端粒酶活性,并上调其催化亚基TERT 的表达,对实验性小鼠CVB3 病毒性心肌炎有明显的治疗作用。