嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞疗法是肿瘤免疫学发展最快的领域之一。近年来,其彻底改变了癌症治疗的模式,并凭借在B细胞白血病和淋巴瘤治疗中出色的临床数据,成为癌症治疗的新突破,为免疫细胞治疗打开了一扇新的大门。但是随着因严重细胞因子释放综合征和脱靶效应而死亡的病例报导,对CAR-T安全性问题的思考也随之而来。关键科学问题是如何进一步提高CAR-T的可控性和安全性。一个可实现的策略是使用自杀基因系统在副作用发生时能够将体内的CAR-T细胞清除从而降低甚至避免副作用对机体的伤害。本论文选用一段截短的人CD38分子作为“开关”标记,与CAR共表达于CAR-T细胞上,建立了一个新型的CAR-T自杀基因系统。另外还对CAR-T构建过程中获得高滴度病毒的浓缩方式优劣做了比较和探讨。主要研究内容如下:首先对人CD38分子进行裁剪,与CAR基因拼接,构建两种结构不同的表达模式。具体步骤为通过分析CD38抗体药达木雷单抗(Daratumumab)的抗体识别表位,裁剪掉CD38胞内段和胞外非结合区段,获得截短的CD38序列(CD38t)。第一种种设计可以实现CD38t分子与CAR分别在细胞膜上共表达,将CD38t序列与引导肽和CD8α跨膜段相连,并通过一段2A自剪切寡肽与CAR相连;第二种设计将CD38t直接与CAR相连,使CD38t与CAR呈“一体化”表达。在二代慢病毒载体上完成了两种CD38t表达模式的构建。其次,通过脂质体转染慢病毒质粒,检测目的所构建质粒的表达情况。然后利用HEK293T细胞包装携带目的基因的慢病毒质粒,以产生有感染效力的病毒颗粒,收集上清获得病毒毒液,并感染T细胞,建立了表达目的基因的稳转细胞系,并以此开展了效果验证。最后,为了方便在人原代T细胞上构建科研级别的CAR-T,需对产生的慢病毒进行浓缩以提高滴度。为此,本研究对常用且较有优势的两种病毒浓缩方法进行了滴度和回收率的比较,为科研级CAR-T的制备做了铺垫。