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近几年提出的肿瘤干细胞学说普遍认为,在几乎所有的肿瘤中都潜伏着极少量的肿瘤干细胞,它们能形成肿瘤并且与肿瘤的转移有关,是所有肿瘤细胞的祖细胞。由于目前临床上对肿瘤的常规治疗方法大都是针对处于增殖阶段的肿瘤细胞,虽然肿瘤能达到消退或缓解,但并没有将肿瘤干细胞完全清除,所以肿瘤往往在一段时间后会复发。因此,寻找到一种理想有效的针对肿瘤干细胞的治疗方法,作为常规肿瘤治疗手段的补充,在减少肿瘤复发和转移,降低病人死亡率,提高肿瘤的治疗效果方面具有一定的理论意义与临床应用价值。磁感应升温热疗,又称磁流体热疗(magnetic fluid hyperthermia,MFH),是一种很有前景的肿瘤治疗方法。它本身的副作用小,将热疗与放疗或化疗联合应用,不仅可以减少放、化疗剂量,从而减少放、化疗副作用,而且可以实现全周期、全空间对癌细胞的杀伤,大大提高疗效。然而,目前热疗单独应用还存在一定的不足,需采用多次热疗来增强疗效,但多次热疗极易诱导热休克蛋白90(heat shock protein,HSP90)的过度表达,从而产生热耐受,抑制肿瘤细胞的凋亡,进而影响热疗疗效。同时,与正常组织相比较,肿瘤组织中本身HSP90表达明显上调。因此,HSP90可以作为治疗肿瘤的靶点。17-丙烯氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG)是HSP90分子伴侣复合物阻滞剂,不仅可以有效地抑制HSP90从而抑制热耐受,本身还是一种独特的可靶向抑制维持肿瘤增殖和生存的细胞信号转导途径的抗肿瘤药物。此外,近期研究表明,肝癌中存在着CD90+肝癌细胞,参与了肝癌的形成,对肝癌的发生、发展具有一定的调控作用,已经被认为是肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)/前体细胞的一个重要标志。因此,基于以上背景,本实验以LCSCs表面标记蛋白CD90作为靶点,以热敏脂质体(thermosensitive liposomes, TSLs)为载体,内部包裹磁性Fe304和17-AAG,表面偶联抗CD90单克隆抗体(anti-CD90 monoclonal antibody, anti-CD90 mAb),靶向输送纳米磁性热敏脂质体(thermosensitive magnetol iposomes, TMs)至肿瘤干细胞部位,在外加交变电流磁场(alternating magnetic field, AMF)作用下,使CD90靶向纳米磁性热敏脂质体磁感应升温发挥热疗及化疗的作用杀灭LCSCs。本研究课题提出了一种全新的靶向肿瘤干细胞的联合治疗方案：在靶向性方面,利用anti-CD90 mAb的生物靶向性,以保证治疗的特异性和安全性；在治疗作用方面,结合17-AAG的生物治疗作用和纳米磁性颗粒磁感应升温的物理治疗作用以及二者的协同作用,以达到治疗的有效性。尽量满足了安全性、有效性、特异性三方面的要求。这些都是新型生物治疗方案真正走向临床前必须回答的问题。本论文以此为背景,进行了如下工作：1. 首先探讨了肝癌组织中CD90表达与临床病理特征的关系,结果显示肝癌组织中普遍表达CD90,其表达与肝癌的分化程度相关,间接证实了CD90可能是LCSCs标志物。然后通过流式细胞仪检测6株肝癌细胞表面CD90的表达,采用免疫磁珠分选法从肝癌细胞株Huh7和BEL-7404中分选出CD90+肝癌细胞,通过细胞增殖实验、分化实验、软琼脂克隆形成实验、Transwell侵袭实验、耐药性实验和成瘤实验对其干细胞特性进行检测和鉴定,直接证实了CD90+肝癌细胞具有明显的干细胞特性。2.采用“旋转蒸发-水化法”制备了载17-AAG的TMs(17-AAG/TMs),随后采用“后插入法”制备抗CD90 mAb修饰的17-AAG/TMs (CD90@17-AAG/TMs)。通过透射电镜(transmission electron microscope,TEM)检测、粒度分析、电位检测、饱和磁化强度检测、示差热分析、傅里叶红外光谱分析(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)、热力学特性检测、热敏释药特性检测和免疫凝集等实验对其物理、化学和生物特性进行表征,并考察了其稳定性。3. 在靶向性方面,我们通过流式细胞仪、激光共聚焦、普鲁士蓝染色、7.0 Tesla Micro-磁共振(magnetic resonance, MR)成像证明了CD90@17-AAG/TMs在体外可以有效地靶向CD90+肝癌细胞。考虑到治疗的特异性和安全性,在活体内我们采用7.0 Tesla Micro-MR磁共振成像和多光谱活体成像系统检测到CD90@17-AAG/TMs可有效的在肿瘤部位富集并累积。4.对于体外抗肿瘤作用的研究,首先通过四唑盐比色(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法、流式细胞仪、治疗后干细胞特性鉴定实验、Western Blot证实了CD90@17-AAG/TMs可以利用17-AAG与热疗中产生的HSP90结合,阻断抗凋亡丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信号通路中Raf-1-MEK-Erk支路与PI3K-AKT支路中的丝氨酸／苏氨酸激酶(serine/threonine protein kinase, AKT)及Ras相关因子(ras-associated factor-1, Raf-1)的磷酸化,进而阻断其信号转导,促进CD90+LCSCs的凋亡,抑制其耐药、侵袭、克隆以及成瘤等干细胞特性。5. 对于体内的抗肿瘤作用的研究,首先构建CD90+LCSCs移植瘤体模型并进行多次热疗,通过肿瘤体积和质量的监测、苏木素-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色法、转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling, TUNEL)染色法、CD90免疫组化(immunohistochemistry, IHC)染色法从体内水平证实了CD90@17-AAG/TMs可以有效地清除CD90+LCSCs,抑制肿瘤的生长。