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背景组织工程骨由种子细胞、外源生长因子、支架材料三部分构成。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)被认为是良好的种子细胞,其在骨修复应用方面已显示出良好的效果；在骨缺损修复中有多种细胞生长因子参与,骨形态发生蛋白2 (Bone morphogenetic protein 2, BMP2)被认为是诱导成骨分化作用的关键生物活性物质,属于转化生长因子TGF-β超家族的一员,它参与调节细胞增殖、种系分化、细胞死亡等一系列的生物过程；血管内皮生长因子165 (Vascular endothelia growth factor 165, VEGF165)在血管再生和骨组织再生过程中起着重要的调节作用。研究证实,纳米羟基磷灰石／聚酰胺66 (nano-hydroxyapatite/polyamide66, n-HA/PA66)具有良好的生物力学性、生物安全性和相容性,临床工作中已将其作为修复支架材料开始应用。然而单独应用n-HA/PA66修复骨缺损尚存在缺陷和不足。因此,选择细胞生长因子表达载体转染BMSCs获得持续、高效表达外源生长因子,以克服外源性生长因子在体内易充散、效价低、时效短等问题。初期动物实验表明,BMP2和VEGF 165蛋白质在骨缺损修复中获得良好的治疗效果。我们此次实验基于之前的研究,通过基因工程构建腺病毒Ad-BMP2-VEGF165,转染BMSCs复合n-HA/PA66,检测hBMP2和hVEGF165目的基因的表达及成骨细胞分化的活动,旨在为体外组织工程骨构建提供技术支持和理论依据,同时为课题后期动物体内骨缺损修复实验奠定良好的细胞学基础。目的1.骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定,获得良好的组织工程骨种子细胞。2. hBMP2与hVEGF165双基因共表达腺病毒载体转染BMSCs,获得高效、持续外源生长因子表达载体。3.体外iBMP2与hVEGF165双基因腺病毒载体转染BMSCs复合n-HA/PA66,构建及检测组织工程骨生物学表达,为组织工程骨体内成骨研究提供分子生物学的方面技术支持和理论依据,同时为课题后期动物体内骨缺损修复实验奠定好细胞学基础。方法1.采用密度梯度离心法分离BMSCs,倒置相差显微镜下观察BMSCs的大体形态,成骨细胞诱导培养21d后,茜素红染色观察细胞内钙结节生成情况；取第3代BMSCs进行细胞表型鉴定。2.通过PCR方法从cDNA文库中扩增BMP2和VEGF165基因,连接到腺病毒穿梭质粒pAd-MCMV-GFP的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pAd-MCMV-BMP2-VEGF 165.然后再与腺病毒辅助质粒pBHGloxΔ (delta) E1,3Cre共转染HEK293细胞包装重组腺病毒Ad-BMP2-VEGF165,经HEK 293细胞扩增纯化后测定病毒滴度。将重组腺病毒转染预先冻存的BMSCs,不同时间点观察目的基因蛋白表达。3.取第3代BMSCs作为细胞实验对象,实验共分2组：Ad-BMP2-VEGF165为实验组和Ad-GFP为对照组；首先用不同感染复数转染BMSCs,并进行ELISA和Western blot检测细胞hBMP2和hVEGF165的表达；其次将转染后的细胞接种到n-HA/PA66生物材料上,7d后扫描电镜观察细胞贴附、生长状况；同时,7d后消化收集贴附n-HA/PA66上的细胞,Western blot检测贴附生物材料细胞中骨钙素(Osteocalcin,OC)和骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)的表达。结果1.密度梯度离心法获得乳白色单个核细胞层,分离得到BMSCs,24 h后倒置显微镜下观察,少许细胞开始贴壁生长,散在分布,呈小梭形或多边形；48 h后首次换液,随培养时间延长,细胞呈梭形,集落逐渐增大,呈漩涡状或人字状排列,原代细胞6-8 d即可达到80%融合,传代后细胞呈梭形,形态大小较一致。BMSCs成骨诱导培养后茜素红染色可见桔红色钙结节形成；第3代细胞表面高表达CD29(99.82%)和CD44(94.14%),低表达CD14(3.11%)和CD34(0.34%)。2.基因测序、菌落PCR、Western blot, GFP表达均观察证实重组腺病毒载体Ad-BMP2-VEGF165构建成功,滴度达1 ×1010PFU/ml。Ad-BMP2-VEGF 165转染BMSCs后,培养液中BMP2与VEGF165及Ad-BMP2组中BMP2在3-28 d均有表达,但是3-5 d时蛋白表达量最高,且与其他时间点相比均有统计学意义,5d以后蛋白表达量逐渐减少,具有时间依赖性。3.腺病毒转染后hBMP2和hVEGF165蛋白水平高表达；扫描电镜见转染细胞分布均匀,生长状态良好。实验组与对照组相比,复合n-HA/PA66后Western Blot检测显示OC和OPN表达均较高,两组差异均有统计学意义(P<0.05)。结论1.BMSCs分离、培养及鉴定成功,早代细胞具有较强的增殖能力,可作为良好的种子细胞用于后续实验。2,携带入BMP2和VEGF165双基因共表达重组腺病毒载体构建成功,并能获得高滴度的病毒转染液。3.Ad-BMP2-VEGF165双基因腺病毒转染BMSCs后目的蛋白较高量表达,同时转染BMSCs后可以在n-HA/PA66进行良好的黏附、生长、增殖、矿化,Ad-BMP2-VEGF165双基因表达组织工程骨成功构建。