第一部分D1多巴胺受体通过Rac1和RhoA调控神经元树突重塑毒品成瘾是一个严重的社会性问题。药物成瘾过程中,大脑多个部位的结构和功能发生改变,其中重要的是神经元结构发生了重塑,这是成瘾发生的结构基础。许多研究报道多巴胺信号通路在可卡因介导的神经元树突重塑中发挥重要的调节作用,并且有研究发现发现D1和D3多巴胺受体对下游的长期诱导的靶基因起到相反的调节作用;这些基因的长期变化,参与神经元可塑性的形成,并进一步参与毒品给药后的行为学变化。神经元形态的可塑性变化是由细胞骨架结构发生的改变而介导的。已证实小G蛋白家族在细胞骨架结构改变方面发挥了重要的作用。小G蛋白家族中最重要的是Rho家族蛋白Rac1、RhoA和Cdc42,这三种蛋白相互协调、相互依赖,共同调节骨架蛋白的结构重组和形成。RhoA和Rac1/Cdc42的作用相反,Rac1/Cdc42对神经元的发生、迁移、生长、维持等起到促进作用,而RhoA对神经元的形成和维持,生长锥的突起起到抑制作用。已有报道称可用体外原代培养的神经元通过多巴胺重复刺激模拟体内药物成瘾,从而对成瘾的信号通路作进一步的解释。而在成瘾过程中,多巴胺受体与Rho家族中各个蛋白的关系及各分子蛋白之间的相互作用却没有得到阐述。本课题利用体外培养的前额叶皮质区(prefrontal cortex,PFC)的神经元,通过多巴胺重复刺激模型构建成瘾模型,利用Rac1和RhoA的活性和无活性突变体慢病毒,研究D1多巴胺受体及Rac1和RhoA在多巴胺重复刺激引起的神经元树突重塑中所起的作用,及D1多巴胺受体对Rac1和RhoA的调控作用,并分析在多巴胺重复刺激模型中,Rac1和RhoA的活性变化及其对彼此的相互影响。从而对药物成瘾中,神经元伴随的形态可塑性变化的分子机制进行进一步的探讨。实验方法:1.实验细胞:原代培养的乳鼠前额叶皮质(PFC)区神经元。2.多巴胺刺激模型:原代培养的前额叶皮质神经元(PFC)培养的第1 1,13,15 d分别加浓度为1μmol/L多巴胺刺激30 min,然后换去全部的培养液,第19d固定细胞做免疫荧光。3.细胞分组:PBS 组,Dopamine 组,BDNF 组,SKF81297 组,SCH23390+Dopamine 组,Rac1N17+Dopamine 组,Rac1L61+Dopamine 组,RhoAL63+Dopamine 组,RhoAN19+Dopamine 组,Plenti-EGFP 组,Plenti-EGFP+NSC23766+Dopamine 组,Plenti-EGFP+Y27632+Dopamine,Rac1L61+SKF81297,Rac1N17+SKF81297,RhoAL63+SKF81297,RhoAN19+SKF81297 组。4.检测指标:①采用免疫荧光染色技术对突触前膜蛋白和突触后膜蛋白synapsin-Ⅰ,PSD-95进行染色,两者共定位区域即为一个突触所在区域,对不同组别的突触数目进行统计分析比较。②G-LISA方法检测在dopamine重复刺激过程中,Rac1和RhoA的活性变化,及两者之间的交互作用变化。5.使用SPSS13.0软件进行统计学分析。所有数据为计量资料,报告数据采用均数±标准差(Mean±SD),实验数据属于完全随机设计资料的多个样本均数的比较,运用SPSS 13.0软件单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用Bonferroni检验,P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果:1.重复多巴胺刺激可以引起PFC区神经元形态可塑性变化,导致突触数量增加。与saline对照组相比,dopamine(DA)重复刺激可以引起神经元突触数目增多53.44%(P<0.001)。与BDNF引起的神经元突触数目增多类似(4.67±0.55)。2.应用D1多巴胺受体抑制剂SCH23390(10μmol/L)、D1多巴胺受体激动剂SKF81297(1μmol/L)以探究D1多巴胺受体在调节PFC细胞重塑中的作用。结果显示:与DA单独重复刺激组比较,在PFC细胞中先应用D1多巴胺受体抑制剂SCH23390后,多巴胺重复刺激引起的神经元形态结构的改变会被显著抑制,神经突触密度降低54.7%(2.12±0.61vs 4.68±0.70,P=0.000);而SKF81297单独刺激后神经元后神经突触密度都显著增加(4.93±0.65),与多巴胺重复刺激类似,提示D1多巴胺受体在多巴胺重复刺激诱导神经元树突重构中发挥正性调控作用。3.应用Rac1和RhoA的活性和无活性的突变体慢病毒转染细胞,同样给与多巴胺重复刺激,探讨Rac1和RhoA是否参与了慢性多巴胺刺激诱导的神经元树突重塑以及其所发挥的作用。结果显示:转染了RaclL61的细胞可导致DA重复刺激引起的神经元突触密度显著增加,与对照组相比有显著统计学差异;转染Rac1N17显著抑制了多巴胺重复刺激引起的神经元及突触密度的增加,与DA对照组相比差异具有统计学意义,这提示Rac1在多巴胺刺激诱导的神经元树突重构中发挥重要的正性调控作用。相反,RhoAL63转染使得DA重复刺激引起的突触密度降低,而转染RhoAN19慢病毒后增强了多巴胺刺激引起突触密度的增加,差异具有统计学意义,提示RhoA在多巴胺介导的神经元树突重塑中发挥负性调控作用。并用Rac1的抑制剂NSC23766以及RhoA下游调控分子ROCK的抑制剂Y27632以探究Rac1和RhoA是否参与了多巴胺重复刺激诱导的神经元树突重塑。该组前皮质细胞在每次加多巴胺刺激前3min加NSC23766(100 μmol/L)或者Y27632(100μmol/L)。细胞固定后进行免疫荧光染色,结果显示:NSC23766显著抑制多巴胺重复刺激引起的神经突触密度增加,这与病毒感染的结果相同,差异具有统计学意义;而Y27632与多巴胺组比较则尚无统计学差异,提示RhoA参与调控DA重复刺激引起的神经元树突重塑不依赖于ROCK通路。4.G-lisa测定结果显示,DA可以引起Rac1活性增高,在40min时达到高峰,同时抑制RhoA的活性,在加入DA后40min达到最低。且这种反应在加入了 D1多巴胺受体抑制剂SCH23390后消失,说明DA通过D1类多巴胺受体来对Rac1和RhoA进行调控,且两者之间存在交互作用(F=52.315,P=0.000)。结论:我们利用原代培养的前额叶皮质区神经元,通过多巴胺重复刺激,建立了药物成瘾的体外模型。发现在多巴胺重复刺激引起的神经元树突重塑中,D1多巴胺受体通过调控Rac1和RhoA来参与神经元树突重塑,并且Rac1和RhoA在调控神经元树突重塑中发挥了相反的作用。第二部分温敏型水凝胶联合activinB对于帕金森病小鼠模型的神经保护作用帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种以中脑黑质多巴胺能神经元进行性退变,神经递质多巴胺缺乏为主要病理生化基础的中老年人常见的运动障碍性疾病。其临床症状主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓等。新近的流行病学调查显示,我国65岁以上人群PD发病率达1.7%,从诊断到死亡的平均生存期为15年。帕金森病的病因和发病机制十分复杂,至今仍未彻底明确,目前所有针对帕金森病的治疗都是对症治疗,尚无根治办法。开展帕金森病机制的研究,并进一步寻找有效的治疗药物,具有深远的社会意义和巨大的市场前景。临床上对PD的治疗主要手段是给予多巴胺(DA)合成的前体物质左旋多巴(L-DOPA),以补充纹状体区丢失的DA。然而,越来越多的临床病例发现,经过长时间的给药,机体对L-DOPA的耐受逐渐增强,该药的作用逐渐减弱,并呈现出强烈的负面效应,甚至起到增重PD症状的副作用。近年来,细胞因子,特别是神经营养因子对PD的治疗作用研究引人注目。与此同时,关于中枢神经系统给药途径、给药方式、药物能否透过血脑屏障、以及神经元是否能够透过层层包裹的胶质细胞而吸收药物等问题依旧没有得到良好的解决。新型生物材料的使用给脑内注射给药提供了一个崭新的视角,采用安全性能良好,生物兼容性好的生物材料,不仅可以包裹有效的细胞因子进入脑内,避免了血脑屏障带来的困难,同时生物材料可以随着体内的降解,起到缓释和支架的作用。我们在体外采用MPP+诱导的SY5Y帕金森病细胞模型,体内运用MPTP腹腔注射构建PD小鼠模型,来研究activinB对于PD模型神经元的保护作用,并将水凝胶联合activinB,通过立体定位方式注射到纹状体CPu区,通过组织病理学和行为学等检测手段,来观察水凝胶联合activinB对于帕金森病神经元的作用。实验方法:1.水凝胶材料组成部分由加拿大曼尼托巴大学Malcolm.Xing教授提供。我们进行了电镜扫描观察其孔径,体外降解实验,吸水溶胀实验,以及核磁分析来检测水凝胶的物理特性。2.体外水平:我们采用MPP+诱导SY5Y细胞,构建帕金森病细胞模型。实验组给予细胞不同浓度的activinB,通过MTT检测细胞活性,hoccest核染,检测其对于帕金森病细胞模型中细胞活性的影响。3.体内水平:首先检测了 activinB对于帕金森病小鼠模型的作用。我们采用MPTP连续5天腹腔注射的方式构建帕金森病小鼠模型,将activinB通过立体定位注射方式注射入小鼠纹状体CPu区,在术后的7,21,35天,分别冰冻切片做免疫组化染色检测纹状体区activinB的剩余量,及纹状体区TH+多巴胺能神经元纤维的密度,来反映纹状体区多巴胺能神经元的存活情况。并选取了两个代表性的行为学检测方法,矿场实验和转棒实验,来反映纹状体对运动协调能力的调节功能。4.体内水平:其次检测了温敏水凝胶包裹activinB在帕金森病小鼠模型中发挥的作用。同样用腹腔注射MPTP的方式构建帕金森病小鼠模型,用水凝胶包裹同样剂量的activinB,通过立体定位注射方式到小鼠纹状体区。在术后7,21,35天,冰冻切片做免疫组化染色检测纹状体区activinB剩余量,纹状体区TH+多巴胺能神经元纤维的密度,及注射部位及周围F4/80阳性细胞情况,来反映水凝胶在体内的生物兼容性。并采用矿场实验和转棒实验来反映纹状体区对运动能力的调节情况。实验结果:1.我们构建的水凝胶是一种温度敏感型水凝胶,在25摄氏度及以下都呈液体状态,一旦进入体内,或者温度达到37度时,其转变为凝胶样状态。我们构建的水凝胶孔径为80-150um,可以极好的包裹细胞因子携带入体内,在体外溶菌酶的作用下约3周左右可以被降解,吸水可以溶胀其体积的8-10倍,核磁扫描分析显示其具有稳定的结构。2.MPP+可以显著的诱导细胞凋亡发生,细胞活性降低,核碎裂核凋亡,从而诱导体外的帕金森病细胞模型。ActivinB 10ng/ml,25ng/ml可以显著改善MPP+导致的细胞凋亡情况,差异有统计学意义。3.实验发现,MPTP可以显著诱导黑质区多巴胺能阳性细胞密度减低,纹状体区TH+多巴胺能神经元纤维的密度降低,与生理盐水对照组皆有明显的统计学差异,且行为学分析显示,MPTP注射组小鼠与saline注射组小鼠相比,在矿场运动中运动总路程,平均运动速度,及转棒时间都有明显的统计学差异,提示我们成功构建了帕金森病模型小鼠。立体定位注射activinB到纹状体CPu区,可以保护MPTP对神经元的损伤,增加纹状体区TH+多巴胺能神经元纤维的密度,改善矿场运动和转棒运动的行为学变化,与单独注射MPTP组有显著的统计学差异。但这种保护作用仅局限于术后7天,在术后21天,35天时,activinB对于小鼠的神经保护作用消失,小鼠呈现出帕金森病样症状及组织病理表现,组织切片也显示在术后7天时可以观测到纹状体区剩余activinB的存在,但在术后21天,35天均检测不到。4.体内实验发现,水凝胶联合activinB可以显著延长activinB在体内的存留时间,在术后7,21,35天均可以检测到activinB的存在,说明水凝胶不仅可以对于activinB有良好的缓释作用,且可以一直保持其活性状态。Anti-TH免疫组化发现,水凝胶联合activinB组的TH+神经纤维密度,在术后的7,21,35天与MPTP组有显著统计学差异。行为学结果显示,与MPTP+saline组相比,在术后7,21,35天,矿场运动中运动总路程及运动平均速度都有显著统计学差异,转棒时间也有显著统计学差异。术后7天,MPTP+activinB组与MPTP+hydrogel+activinB组无显著统计学差异,但是随着时间延长,术后21天,35天,MPTP+hydrogel+activinB组呈现明显的优势,与MPTP+activinB组有明显统计学差异。5.Anti-F4/80结果显示,水凝胶可以引起注射区域周围轻微的炎症反应,并无周围组织严重炎症反应发生,显示hydrogel与组织良好的相容性,也轻微的炎症细胞可以释放一定的神经保护因子,从而促进疾病修复。结论:ActivinB可以降低MPTP诱导的PD模型中的神经元损伤,具有神经保护作用。我们构建的hydrogel是一种生物兼容性良好可降解的新型生物材料,可以在体内对activinB进行很好的缓释作用,从而延长药效,达到更好的治疗效果。第三部分磁性纳米颗粒通过p-JNK通路诱导小鼠海马区和纹状体区神经元毒性发生研究背景及目的:纳米颗粒作为新型生物材料,应用于社会生活的诸多方面。磁性纳米颗粒的出现,因为其独有的诸多特性,体积小,接触面积大,高反应性,以及高负荷载药性,吸引了各界人士的注意。在过去的诸多年里,纳米颗粒被广泛应用于机械制造加工业,食品加工业,以及肿瘤治疗,靶向药物传递系统。除此以外,因为其具有穿透血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的作用纳米颗粒被广泛的应用于中枢神经系统疾病治疗.如此多的应用范围必将引起人们对于纳米颗粒安全性能的关注,其是否在体内引起人体微环境或者组织器官的损害性改变。且人类生活的环境中也存在纳米颗粒,比如,有报道称被吸入的纳米颗粒可以进入人脑并引起行为学损伤。因此,研究纳米颗粒的毒性,对于更好的利用其优势,避开其缺陷有重要的意义。研究方法:1.细胞模型:PC12细胞株,5×106密度接种于六孔板中,5×104密度接种于96孔板中。2.细胞分组:saline对照组,nanoparticle实验组,实验组采用10-100 ug/mlnanoparticle与细胞共孵育。3.检测指标:①CCK法检测细胞活性:96孔板中培养的PC12细胞血清饥饿24h,nanoparticle10-200ug/ml孵育24h,之后CCK法检测细胞活性;②细胞活力分析仪进行细胞死活分析:六孔板细胞血清饥饿,之后nanoparticle孵育24h,消化制成细胞悬浮液,机器进行读数分析细胞活力;③细胞形态观察:六孔板细胞血清饥饿,六孔板细胞与25,50,75,1 00ug/ml nanoparticle共孵育24h以后,加入NGF诱导细胞分化,第7天进行细胞骨架染色观察细胞形态变化;④透射电镜观察:六孔板细胞血清饥饿,与25,50,75,1 00ug/ml nanoparticle共孵育24h以后,细胞刮刮取细胞,离心,固定细胞团块儿,染色切片进行透射电镜扫描;⑤western blotting:六孔板细胞血清饥饿,与25,50,75,100ug/ml nanoparticle共孵育24h以后,细胞裂解液裂解细胞提取蛋白,检测TH的表达;以及细胞与 100ug/ml nanoparticle 共孵育后 10min,30min,60min,120min 后,提取细胞蛋白进行p-JNK,t-JNK,p-P38,t-P38蛋白表达分析。4.动物模型:C57雄性小鼠,8-10周龄,采用立体定位注射方式将20ug nanoparticle注射入小鼠纹状体区和海马区。5.动物分组:saline注射组,nanoparticle注射组。6.检测指标:①HE:术后7天,14天,小鼠灌注固定取脑,常规脱水透明石蜡包埋,石蜡切片进行HE染色观察大体形态;②Anti-TH免疫组化:术后7天,14天,小鼠灌注固定取脑,冰冻切片进行anti-TH观察nanoparticle注射入纹状体区对TH+多巴胺能神经纤维造成的影响;③TUNEL染色:术后7天,14天,小鼠灌注固定取脑,冰冻切片,TUNEL试剂盒检测纹状体区和海马区细胞调亡情况;④Western blotting:于立体定位注射nanoparticle进入纹状体和海马区之后的10min,30min,60min,120min,分别分离组织提取蛋白,检测p-JNK,t-JNK,p-P38,t-P38蛋白表达;⑤行为学检测:于术后7天,14天,纹状体注射组小鼠行矿场,转棒行为学检测,海马注射组小鼠行morris水迷宫检测。7.结果用SPSS13.0进行统计学分析。研究结果:1.体外实验中,CCK-8结果及细胞活力分析仪结果显示,nanoparticle可以剂量依赖性的引起细胞活性降低。在10-50ug/ml nanoparticle与细胞共孵育的过程中都对细胞活性没有造成影响(saline:98.91±0.62%;10ug/ml:99.12±0.32%;20ug/ml:98.68±0.70%;30ug/ml:99.11±0.32%;40ug/ml:98.72±0.51%50ug/ml:98.95±0.59%,P>0.05),一旦 nanoparticle 浓度超过60ug/ml,即可对细胞造成影响,导致细胞活性降低,差异具有统计学意义。(60 ug/ml:77.1 ± 1.22%;70 ug/ml:74.1±2.50%;80 ug/ml:60.43±2.67%;90 ug/ml:53.25±3.43%;100 ug/ml:52.80±2.86%;2000 ug/ml:27.01±1.82%,F=941.695,P=0.000)。细胞活力分析仪结果也显示,nanoparticle在25ug/ml,50ug/ml时,细胞活力未受影响(saline:1.00±0.05;25ug/ml:0.99±0.01;50ug/ml:0.99±0.01),在75ug/ml(0.74±0.03)和100ug/ml(0.52±0.02)时,细胞活力受到影响,差异有统计学意义,P=0.000。将与 25,50,75,100ug/ml 的 nanoparticle 共孵育 24h 后的 PC12细胞提取蛋白做anti-TH的western blotting检测发现,75ug/ml和100ug/ml可导致TH表达显著性降低,P=0.000。NGF可以诱导PC12细胞向神经元方向分化,产生树突分支,事先给与100ug/ml的nanoparticle与细胞共孵育24h,再给与NGF诱导下,与对照组相比,细胞分化能力消失,细胞开始变圆,产生分支的能力降低。这可能因为nanoparticle对细胞骨架造成的毒性影响所引起。2.细胞与 saline,25ug/ml,50ug/ml,75ug/ml,100ug/ml 浓度的 nanoparticle共孵育24h以后,细胞固定超薄切片做透射电镜观察,结果显示。在25,50ug/ml时,细胞可以通过细胞膜性成分的凹陷,内吞,对nanoparticle进行正常吸收,24h后nanoparticle存在于细胞的膜性成分中,细胞胞膜完整,胞核未受损,线粒体等细胞器正常。但是在75,100ug/ml时,细胞不再对nanoparticle进行正常的内吞,细胞出现了核碎裂,包膜不再完整,线粒体肿胀,破碎,释放出大量的溶酶体,细胞呈现典型的凋亡状态。因此我们推测,在低浓度的nanoparticle刺激下,细胞不受影响,可以正常的存活生长,而在高浓度刺激下,细胞开始启动凋亡程序。3.Nanoparticle以立体定位注射方式注射到大脑两个最重要的脑区:纹状体和海马区,第7天和第14天分别灌注固定分离脑组织,常规脱水透明包蜡块,石蜡切片进行HE染色观察。结果显示,在注射区及周围散在分布磁性纳米颗粒,海马区可见纳米颗粒分布区苏木素标记蓝色细胞核显著减少,纹状体区也可见细胞核呈现核凋亡状态,但与注射生理盐水组相比,周围组织无明显的形态学损伤,也无明显组织受压或者组织坏死现象发生。4.Nanoparticle注射入纹状体区后的7,14天,冰冻切片做anti-TH免疫组化,结果发现,nanoparticle可以导致纹状体区TH阳性的神经纤维密度降低(7d:53±6.61%vs 100±1.15%;14d:57±2.8%vs 100±1.79%),说明nanoparticle对多巴胺能神经元有损害作用,提示nanoparticle对于中枢神经系统的损害可能和神经退行性疾病相关。纹状体区和海马区组织切片做TUNEL检测细胞凋亡显示,术后7天,海马区细胞凋亡数目31.5±2.6,纹状体区29.6±4.2,与注射saline对照组相比都有显著的统计学差异。术后14天,海马区细胞凋亡数目1 7.8±2.3,纹状体区凋亡细胞数目19.3±2.1,与生理盐水对照组也有显著的统计学差异(P=0.000)。5.体外细胞学实验中,将100ug/ml nanoparticle与PC12细胞共孵育10min,30min,60min,120min后收集细胞提取蛋白,检测p-JNK,p-P38的表达,结果发现,共孵育10min就可激活p-JNK的表达,在120min时仍持续升高,与saline注射组有显著的统计学差异(F=275.097,P=0.000)。而p-P38的表达未发生任何改变(F=1.735,P=0.161)。脑部立体定位注射 nanoparticle 后的 10min,30min,60min,120min处死小鼠提取脑组织蛋白,发现海马区和纹状体区与体外结果完全一致,共孵育10min后即可有p-JNK的激活,持续到120min仍有大量激活,与saline对照组相比差异有统计学意义(海马区:F=770.846,P=0.000;纹状体区:F=308.946,P=0.000)而p-P38未被激活,与saline对照组无统计学差异(海马区:F=1.206,P=0.323;纹状体区:F=2.079,P=0.102)。6.立体定位注射入脑部纹状体区和海马区后,分别在术后7天和14天进行相关行为学检测。纹状体注射组采取矿场和转棒实验发现,与注射saline组相比,注射nanoparticle组小鼠矿场行为学表现未见异常,转棒时间在第7天时有明显统计学差异,14天时差异消失。海马区注射组采取morris水迷宫行为学检测,7天时,与对照组相比,实验组小鼠平均游泳速度无显著性差异(23.7±3.3 vs 22.2±2.1 cm/s,P=0.219),目标象限路程百分比具有统计学差异(24.0±9.2%vs 41.8±17.3%,t=3.075,P=0.006),目标象限时间百分比也具有统计学差异(26.2±9.2%vs 40.7±19.4%,t=2.245,P=0.036),14 天时,实验组小鼠平均游泳速度与对照组相比亦无显著性差异(23.2±2.1 vs 23.1±3.2),目标象限路程百分比具有统计学差异(21.3±7.3%vs 31.9±4.3%,t=4.159,P=0.000),目标象限时间百分比也具有统计学差异(26.6±6.9%vs 37.5±6.5%,t=3.792,P=0.001)。结论:体内和体外实验发现,磁性纳米颗粒在低浓度下不对细胞活性造成损害,在高浓度时可以激活JNK通路诱发细胞凋亡,降低细胞活性,并对小鼠行为学产生影响。