论文部分内容阅读
目的探讨miR-378对高糖作用下成骨细胞增殖分化的影响及可能的机制。方法1)采用慢病毒表达载体进行细胞转染;2)采用MTT法建立高糖模型;3)观察高糖环境对成骨细胞增殖分化的影响:通过茜素红染色法了解对成骨细胞矿化的影响;分别通过MTT法和流式细胞仪判断成骨细胞增殖和凋亡情况;通过对硝基苯酚法检测成骨特异标记物碱性磷酸酶(ALP)和通过Real time PCR方法检测成骨相关基因表达;4)确定miR-378靶基因:采用生物信息学预测结合荧光素酶报告检测和Real time PCR、Western Blot检测;5)采用RNA干扰技术构建靶基因shRNA质粒,并通过慢病毒转染的方式沉没靶基因在MC3T3-E1细胞中的表达;6)miR-378对PI3K/Akt信号通路的影响以及加入PI3K/Akt信号通路阻断剂后目的蛋白的变化:采用Western Blot方法检测目的蛋白(p-PI3K,PI3K;p-Akt,Akt;CytC,Apaf-1,Bax)。结果1)确定25.5 mM高糖浓度为后续实验的高糖模型;2)高糖可抑制MC3T3-E1细胞的生长和ALP活性以及成骨相关蛋白的表达;高糖可使茜素红染色区域和钙化减少,抑制MC3T3-E1细胞的矿化;高糖可促进MC3T3-E1细胞凋亡;高糖条件下MC3T3-E1细胞内miR-378表达下调;3)与对照组(HG组和HG+miR-con组)相比,过表达miR-378(HG+miR-378组)可提高高糖作用下MC3T3-E1细胞内miR-378的含量;可减轻高糖对MC3T3-E1细胞生长的抑制以及高糖引起的MC3T3-E1细胞凋亡,促进高糖下MC3T3-E1的矿化,提高ALP活性以及促进成骨相关蛋白的表达;4)生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验以及real time PCR和Western blot检测证实miR-378的靶基因是caspase-3;5)过表达mi R-378可下调成骨细胞caspase-3 mRNA和蛋白质水平表达;干扰CASP3可提高被高糖抑制的ALP活性以及促进成骨相关基因的表达;6)mi R-378过表达显著促进了PI3K/Akt信号通路p-PI3K和p-AKt蛋白的表达,而加入PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002后,p-PI3K和p-AKt蛋白表达受阻,表明miR-378是通过PI3K/Akt通路发挥作用。miR-378过表达可抑制凋亡相关蛋白CytC、Apaf-1和Bax的表达;而加入PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002后,凋亡相关蛋白CytC、Apaf-1和Bax的蛋白表达又重新恢复,促进MC3T3-E1细胞细胞凋亡。以上结果提示,mi R-378是通过PI3K/Akt信号通路调节凋亡相关蛋白的表达,从而影响成骨细胞生长、分化。结论过表达miR-378可通过下调靶基因caspase-3改善高糖抑制的成骨细胞分化。作用机制可能包括:通过直接靶向调控caspase-3,抑制通过caspase-3依赖方式引起的细胞凋亡;通过PI3K/Akt信号通路调控凋亡相关蛋白的表达,减少成骨细胞凋亡。