目的：探讨猪骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）增殖和分化潜能的不均一性，以及自发分化和5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞的潜能。方法：抽取中华小型猪骨髓，密度梯度离心法[Percoll（1.077g／ml）]分离出单个核细胞，贴壁培养法筛选MSCs，原代（PO）培养后按1：3比例每3天传代一次。选取第1，4，8和10代（P1，P4，P8和P10）MSCs，研究其向心肌样细胞白发分化潜能，以及在5-氮胞苷诱导后4周能否分化为心肌细胞。连续镜下观察其形态变化；计数法分析MSCs增殖模式；免疫细胞化学染色法检测MSCs的表面标志（CD34、CD45、CD90和SH2）及心肌细胞特异性的蛋白表达，包括a-横纹肌肌动蛋白（a-sarcomeric actin，a-actin）、心肌肌钙蛋白-T（cardiactroponin-T，cTn-T）、肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）和连接蛋白43（connexin 43，Cx43）；以Real Time RT-PCR定量检测分化细胞是否表达心肌特异性基因及其表达量，包括GATA4、肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）、MHC、肌浆网受磷蛋白（phospholamban）、a-actin、Cx43、结蛋白（desmin）和骨骼肌肌动蛋白（skeletal muscle actin，SM-actin）；透射电镜观察分化细胞超微结构。结果：体外培养条件下，P1、P4、P8和大部分P10代MSCs形态一致，呈梭形成纤维细胞样形态，但部分P10代细胞多核、胞浆延长、和邻近细胞相互连接，转变为肌管样形态。5-氮胞苷诱导1周后，部分P1、P4和P8代MSCs表现为较长的胞浆形态和多核化，4周后更多细胞相互连接形成不规则的管样结构，而P10代MSCs则形成相对规则的肌管样结构。计数法显示，各代MSCs培养3天后开始进入对数生长期直至平台期。P1、P4和P8代MSCs增殖速率相似（P=0.908），倍增时间（population doubling time，PD）约48h。和上述早代MSCs相比，接种3天后，P10代MSCs增殖速率显著变慢（P＜0.05），PD约为72h。免疫细胞化学染色显示超过95％的贴壁细胞表达CD90、SH2，而不表达CD34、CD45，说明绝大多数贴壁细胞为MSCs。自然培养的P1、P4和P8代MSCs不表达心肌特异性结构蛋白，而部分P10代MSCs（10.3±1.8％）表达心肌特异蛋白：α-actin，MHC和cTn-T。各代MSCs经5-氮胞苷诱导后4周，均表达上述蛋白；其中，P1、P4和P8代MSCs向心肌细胞分化效率相似（18.3±8.2％vs 17.6±11.9％vs 16.5±5.0％，P＞0.05），但均显著低于P10代MSCs的诱导成心肌细胞分化效率（44.5±4.2％，P=0.0001）。RT-PCR结果表明，P1、P4和P8代MSCs在自然培养状态下无心肌特异性基因表达，而P10代MSCs则表达心肌特异性转录因子GATA4和结构基因desmin、phospholabman、MHC和MLC。5-氮胞苷诱导后4周，各代MSCs均表达上述基因。实时定量PCR结果表明，GATA4（P=0.018）和MLC（P＜0.0001）在P10代MSCs诱导后4周的表达丰度显著高于同期诱导的P4代诱导分化细胞。透射电镜显示在自然培养状态下，P1、P4和P8代MSCs无任何肌细胞样结构，而部分P10代MSCs有不规则肌丝；5-氮胞苷诱导后4周，P1、P4和P8代MSCs分化的细胞有较多不规则肌丝、散乱肌节和横纹，而P10代MSCs分化的细胞可见丰富肌丝、规则肌节和横纹，尤其是闰盘结构。结论：1．猪骨髓MSCs在体外自然培养条件下，形态学、增殖能力和分化潜能是不均一的，从P10代开始增殖变慢、部分细胞自发分化为心肌样细胞。2．5-氮胞苷可诱导MSCs分化为心肌样细胞，但是P10代MSCs分化的心肌细胞更趋成熟，具有相对成熟的心肌细胞结构，且分化效率更高。目的：研究¹⁸氟—脱氧葡萄糖(¹⁸fluoro deoxy-glucose，¹⁸F^-FDG)标记的骨髓单个核细胞（mononuclear cells，MNCs）经冠状动脉输注后在急性心肌梗死（acutemyocardial infarction，AMI）猪模型的早期全身分布、心肌内定位和对心功能的影响。方法：选取10月龄中华小型猪14头（30±5kg），分为对照组（经冠脉输注PBS，n=7）和移植组（经冠脉输注自体骨髓MNCs，n=7）。开胸后于紧靠第一对角支开口稍远处，胶管套扎左前降支（left anterior descending，LAD）冠状动脉90分钟制备AMI模型。AMI后1周，抽取自体骨髓分离出MNCs，以放射性同位素¹⁸F-FDG（5mCi=185MBq）和荧光染料DAPI标记，调密度至1×10⁹细胞／10ml。以over-the-wire balloon球囊导管在LAD结扎处阻断前向血流，同时输注标记的MNCs（1×10⁹细胞／猪，n=6），1小时后以双核素(¹⁸氟／⁹⁹锝)—单光子发射计算机断层扫描（single photon emission computed tomography，SPECT）检测其全身分布和心脏内定位。分别以AMI后1周（移植当天）和移植后6周作为考察基线和终点，以^99m锝-甲氧基异丁基异腈(^99mTc-MIBI)-SPECT检测心肌灌注缺损，以核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）检测心功能。终点指标检测结束后处死动物进行组织学检测，免疫组化法检测MNCs在梗死区和梗死周边区分化潜能以及毛细血管密度。结果：AMI后24h内对照组和移植组分别有一只动物死于心力衰竭和心室颤动。¹⁸F^-FDG标记后即刻，MNCs活力达97％以上，标记后1小时仍在93％以上，与非标记MNCs相似。放射活性检测表明，90.8±1.9％的放射性活性存留于MNCs中，上清液中放射性活性小于10％。DAPI对活细胞的标记效率为100％。MNCs经冠脉输注后1小时，¹⁸F-FDG-SPECT显示，心脏中的放射活性占全身的6.8±1.8％，90％以上的放射活性位于肝、脾和外周循环。双核素SPECT扫描相同层面的心肌并进行图像重叠，显示在所有移植动物心脏中，¹⁸F-FDG放射活性全部聚集于灌注缺损区，相关性分析表明，心脏中放射活性强度与灌注缺损面积呈显著正相关（P=0.001，相关系数=0.973）。基线时对照组和移植组心肌灌注缺损面积无显著差异（47.1±7.5％vs45.6±6.6％，P=0.713），终点时，移植组灌注缺损面积显著小于对照组（23.9±5.1％vs 44.8±6.7％，P＜0.0001）。MRI检测表明，基线时，对照组和移植组的各项心功能参数无显著差异（P＞0.05）。终点时，与对照组相比，移植组的心功能各项参数除左室舒张末期容积（end-diastolic volume，EDV）外均有显著改善，其中左室射血分数（leftventricular ejection fraction，LVEF）由43.9±8.5％增加到51.2±10.4％（差值d=7.3±4.8％），而对照组由43.5±7.3％变为44.2±8.2％（d=0.7±2.0％，P=0.011）；左室收缩末期容积（end-systolic volume，ESV）由32.0±10.1ml变为31.5±10.3ml（d=-0.5±3.3 ml），而对照组则从34.7±6.4 ml增加到38.5±7.3ml（d=3.8±3.1ml，P=0.039）；运动障碍节段数由8.2±1.2个减少至4.8±0.8个（d=-3.3±0.5），对照组由7.8±1.0个减少为7.2±0.8个（d=-0.7±0.5，P＜0.0001）；室壁增厚率从-18.2±7.3％增加至45.7±11.1％（d=63.8±4.1％），对照组从-17.5±6.3％减至-22.3±5.7％（d=-4.8±3.9％，P＜0.0001）；梗死面积从6.9±1.1 cm²减小为3.7±0.7 cm²（d=-3.1±0.8cm²），而对照组从6.6±0.8cm²变为6.9±0.4cm²（d=-0.3+0.5 cm²，P＜0.0001）；左室质量指数从59.8±8.9g／m²增加到64.2±7.9g／m²（d=-4.3±1.5g／m²），而对照组从61.7±7.2g／m²变为72.7±4.6g／m²（d=-11.0±4.4 g／m²，P=0.007）。移植组EDV由56.2±8.4ml变为63.3±7.8ml（d=7.2±4.1ml），而对照组则从58.8±6.6ml增加到68.7±5.3ml（d=9.8±2.6ml，P=0.211）。H&E染色和Masson’s三色染色结果显示，对照组心肌梗死区有严重纤维化和炎症细胞浸润，存活心肌较少，而移植组纤维化和炎症细胞浸润较轻，且伴有存活心肌。免疫荧光显示DAPI标记的细胞表达心肌和血管特异性的结构蛋白，包括α-横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白T、连接蛋白43、Von Willebrand因子和血管平滑肌肌动蛋白。与对照组比较，移植组梗死区（1.8±0.5 vs 3.7±1.1／HPF，P＜0.003）和梗死周边区（8.7±2.0 vs 4.9±1.3／HPF，P＜0.003）毛细血管密度均显著增加。结论：本研究表明：1．¹⁸F-FDG标记和双核素SPECT显像可以用于监测骨髓MNCs经冠脉输注后全身分布和心肌内定位。2．经冠脉输注骨髓MNCs可显著减小灌注缺损面积、改善心功能和阻止心室重塑。目的：探索性研究以通心络超微粉和他汀类药物改良急性心肌梗死（acutemyocardial infarction，AMI）猪模型的心肌微环境，对移植骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在体存活、分化和生物学活性的影响。方法：56只中华小型猪（30±5kg）分为8组，每组7只：对照组、MSCs移植组、单纯通心络超微粉、辛伐他汀和阿托伐他汀干预组、三种药物改良+MSCs移植组。开胸结扎左前降支冠状动脉90min制备AMI模型，再灌注后随即于梗死区和梗死周边区心肌内注射自体骨髓MSCs（3×10⁷细胞／500μl），对照组以相同方法注射500μl低糖DMEM培养基。在6个药物干预组，分别于AMI前3天开始给予口服小剂量通心络超微粉（0.05g／d．kg）、辛伐他汀（0.25mg／d．kg）和阿托伐他汀（0.25mg／d．kg），AMI当天和其后继续使用4天。在移植后1周（基线）和6周（终点），以单光子发射计算机断层显象（singlephoton emission computed tomography，SPECT）和核磁共振成像（magneticresonance imaging，MRI）检测心肌灌注缺损和心功能。免疫荧光检测移植细胞在体存活和分化；TUNEL法检测梗死周边细胞凋亡；分别以黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定梗死区超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；以Western blot免疫印迹法检测梗死区白细胞介素-1β（interleukin--1β，IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosisfactor，TNF-α）的表达水平，以及梗死周边区促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平。结果：SPECT扫描显示，基线时各组心肌灌注缺损面积无显著差异（51.8±16.5％，46.5±9.2％，47.9±12.2％，52.7±15.5％，49.7±16.8％，53.7±14.9％，48.9±15.9％vs 50.7±14.5％，P＞0.05）。终点时，MSCs组、通心络超微粉组和对照组无显著差异（47.3±13.2％，44.8±13.9％vs 47.8±11.1％，P＞0.05），而辛伐他汀组和阿托伐他汀组灌注缺损面积均小于对照组（39.3±12.4％，38.7±13.1％vs47.8±11.1％，P＜0.05）；尤其是通心络超微粉+MSCs组、辛伐他汀+MSCs组、阿托伐他汀+MSCs组的灌注缺损面积进一步显著减小（27.6±7.4％，28.3±7.7％，29.3±9.0％vs 47.8±11.1％，P＜0.05）。MRI检测显示，各组心功能参数在基线时无显著差异（P＞0.05）。终点时，与对照组相比，MSCs组和通心络超微粉组的各项心功能参数均无显著差异（P＞0.05），而辛伐他汀组运动障碍节段数（P=0.039）和梗死面积（P=0.0061）、阿托伐他汀组的运动障碍节段数（P=0.04）均小于对照组。和对照组相比，在通心络超微粉、辛伐他汀和阿托伐他汀改良的MSCs移植组，除左室舒张末期容积（end-diastolic volume，EDV）外，各项心功能参数均有显著改善（P＜0.05）。H&E染色和Masson’s Trichrome染色显示，在对照组，梗死区呈连续性大片状纤维化，有较多炎性细胞浸润，未见存活心肌细胞。MSCs组和通心络超微粉组心肌梗死区和对照组相似，而辛伐他汀组和阿托伐他汀组梗死区纤维化和炎性细胞浸润稍轻，有少量存活心肌。在通心络超微粉、辛伐他汀和阿托伐他汀改良的MSCs移植组，炎症细胞浸润显著减轻，存活心肌较多，纤维化呈散在分布。在通心络超微粉、辛伐他汀和阿托伐他汀改良的MSCs移植组，移植细胞在体存活显著多于单纯MSCs移植组（223.1±26.9，310.6±83.8，373.9±90.3 vs73.2±21.3／HPF，P＜0.0001）。在各MSCs移植组，均有部分移植细胞表达心肌细胞特异性蛋白和血管内皮细胞特异性的因子Ⅷ；但三种药物改良的MSCs移植组，移植细胞向心肌细胞分化效率均显著高于单纯MSCs移植组（55.6±12.1％，46.0±5.1％，44.4±12.5％vs 8.7±2.4％，P＜0.0001）。各移植组均有部分MSCs表达心肌细胞特异性的连接蛋白Connexin43，但上述三种药物改良的移植组Connexin43表达显著强于单纯MSCs移植组（22.4±6.6，17.0±1.6，14.2±2.6 vs4.7±1.8，P＜0.0001）。与对照组相比，MSCs组、通心络超微粉组、辛伐他汀组和阿托伐他汀组梗死区（1.8±0.8，1.9±0.5，2.2±0.7，1.9±0.6 vs 1.8±0.5／HPF，P＞0.05）和梗死周边毛细血管密度（5.2±1.4，5.4±0.8，5.4±1.2，5.4±1.0 vs 4.9±1.3／HPF，P＞0.05）均无显著性差异；而三种药物改良的MSCs移植组梗死区（4.1±0.7，3.9±1.0，3.9±0.9vs 1.8±0.5／HPF，P＜0.0001）和梗死周边毛细血管密度（8.9±1.7，8.5±1.6，8.6±1.2vs 4.9±1.3／HPF，P＜0.0001）均显著高于对照组。终点时，对照组凋亡指数显著高于Sham组（10.1±1.8 vs 0.9±0.3，P＜0.0001），MSCs组（9.2±1.4，P＞0.05）和对照组无显著差异，而通心络超微粉组（5.6±1.7）、辛伐他汀组（5.7±1.5）和阿托伐他汀组（5.2±1.9）凋亡指数均显著小于对照组（P＜0.0001），和单纯药物干预组相比，各药物改良的MSCs移植组凋亡指数进一步减小（2.4±0.5，2.3±0.3，1.9±0.3，P＜0.0001）。Western blot检测表明，对照组促凋亡蛋白Bax表达显著增加（P＜0.0001），抑凋亡蛋白表达显著降低（P＜0.0001）；和对照组相比，MSCs组、三种药物组和药物改良的MSCs移植组均使Bax表达降低（P＜0.0001）和Bcl-2增加（P＜0.0001）；其中，各药物改良的MSCs移植组在药物组的基础上使Bax表达进一步降低（P＜0.05）。终点时，对照组梗死区SOD活力较Sham组显著降低（82.5±8.2 vs 122.5±12.2U／mg蛋白，P＜0.0001），MSCs组（88.6±8.3 U／mg蛋白）和对照组相比无显著性差异（P＞0.05）；但通心络超微粉组（95.5±9.6U／mg蛋白）、辛伐他汀组（100.8±12.1U／mg蛋白）、阿托伐他汀组（98.8±13.4U／mg蛋白）、通心络超微粉+MSCs（101.7±9.1U／mg蛋白）、辛伐他汀+MSCs（108.5±10.2U／mg蛋白）和阿托伐他汀+MSCs组（109.0±13.8U／mg蛋白）均显著高于对照组（P＜0.0001）。对照组梗死区MDA含量较Sham组显著升高（9.0±0.8 vs 5.5±0.9nmol／mg蛋白，P＜0.0001），MSCs组（8.5±0.6nmol／mg蛋白）和对照组相比无显著差异（P＞0.05）；而通心络超微粉组（5.9±0.7nmol／mg蛋白）、辛伐他汀组（5.8±0.7nmol／mg蛋白）、阿托伐他汀组（5.7±1.3nmol／mg蛋白）、通心络超微粉+MSCs（5.7±0.7nmol／mg蛋白）、辛伐他汀+MSCs（5.6±0.9nmol／mg蛋白）和阿托伐他汀+MSCs组（5.5±1.1nmol／mg蛋白）均显著低于对照组（P＜0.0001）。Western blot检测显示，对照组梗死区IL-1β，IL-6和TNF-α表达较Sham组显著升高（P＜0.0001），和对照组相比，MSCs组、三种药物干预组和药物改良的MSCs移植组梗死区上述因子表达均显著降低（P＜0.0001）。结论：本实验表明：1．在AMI再灌注后即刻心肌内移植自体骨髓MSCs，其存活和分化能力有限，尽管能抑制促凋亡蛋白和部分炎症因子的表达，但并未产生显著的心功能获益；2．围移植期使用通心络超微粉、辛伐他汀和阿托伐他汀可显著改良梗死心肌局部微环境，增强移植的骨髓MSCs在体存活和分化，产生显著的心功能获益。