布鲁氏菌是引起动物源性人畜共患病布鲁氏菌病的病原,能导致家畜和野生动物不育、流产、产死胎和木乃伊胎,给全球畜牧业造成了巨大的经济损失。布鲁氏菌为兼性胞内寄生菌,无经典毒力因子,无荚膜,但有很强的致病性。该菌能够在被巨噬细胞胞吞后,内化进入溶酶体定殖,形成布氏小体改变胞内环境,抑制细胞自噬途径,调节免疫因子释放,改造最适环境后大量复制并适时释放。胞内寄生机制在布鲁氏菌侵染中发挥了重要作用,本研究证明了胞外囊泡促进了布鲁氏菌的胞内增殖,为研制新型疫苗、发掘药物靶标和诊断标识提供理论基础,也为其它胞内寄生菌的防控提供借鉴。布鲁氏菌感染病人早期会出现虚汗、盗汗等症状,早期易于误诊耽误最佳治疗时机。为研究汗液生物标志物的特性,本研究分离和纯化了汗液外泌体作为对象。透射电镜下汗液外泌体呈典型的茶杯状结构,动态光散射显示其粒径在50到200纳米之间,针对细菌16S r DNA的PCR表明提取过程排除了细菌的影响,色谱分析排除了油脂的影响,Western blot表明该提取过程能够提取到排除细胞碎片的完整汗液外泌体,之后,本研究将分离的汗液外泌体进行了非标记Label free的蛋白组鉴定,鉴定到了1062种蛋白质,其中有13种抗菌蛋白或多肽。除已报道的10种抗菌蛋白或多肽,组蛋白H2B 2-C型、组蛋白H2B、组蛋白H2A和组蛋白H1.3是首次在汗液中发现。在亚细胞定位分析中,大部分的汗液外泌体蛋白亚细胞定位于胞外、细胞质和细胞膜;在生物学功能分析中,大部分汗液外泌体蛋白集中在代谢功能和细胞功能;在分子功能方面,大部分汗液外泌体蛋白集中在催化活性、结合活性、结构活性和转运活性。相比于汗液,汗液外泌体蛋白谱新发现了997种蛋白质;而与唾液外泌体、尿液外泌体及血浆外泌体比较,汗液外泌体有5种共同的蛋白和896种独特的蛋白质,其中包含已报道的精神分裂症、老年痴呆症和外胚层发育不良的生物标记物。同时本研究分离提取了汗液外泌体的mi RNA表达谱,RNA-seq鉴定了284种mi RNA的存在,RT-PCR证实了mi RNA-203a和mi RNA-1246的存在。本研究通过鉴定汗液外泌体的蛋白质和mi RNA表达谱,鉴定了大量抗菌蛋白和生物标记物,为布鲁氏菌的早期诊断提供了理论参考。同时,本研究选择了模拟布鲁氏菌侵染细胞的体内条件的饥饿酸性和中性条件培养羊种布鲁氏菌,利用蔗糖垫层超高速离心分离了布鲁氏菌两种条件的外排囊泡,用透射电镜证明了布鲁氏菌外排囊泡的完整性,动态光衍射和纳米粒径分析鉴定了外排囊泡粒径的正态分布。Western blot表明外排囊泡包含间质蛋白和外膜蛋白,label free的蛋白谱鉴定了酸性和中性条件下布鲁氏菌外排囊泡中的310种蛋白质。功能注释分析发现在亚细胞定位上外排囊泡蛋白集中在细胞组成和细胞膜上,生物功能集中在胞内进程和代谢,分子功能集中在催化和结合活性上。布鲁氏菌外排囊泡的小RNA组测序鉴定了三条高丰度的小RNA。两种布鲁氏菌外排囊泡孵育巨噬细胞后,都能显著增强布鲁氏菌在巨噬细胞中的增殖;ELISA检测显示布鲁氏菌在不同条件下诱导产生的外膜囊泡都有刺激巨噬细胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力;q RT-PCR显示布鲁氏菌外排囊泡孵育能显著上调巨噬细胞AIM2、STING-α、STING-β、IFN-β、p65、IL-10、IL-6的RNA水平。布鲁氏菌外排囊泡的一系列蛋白组学、小RNA组和共培养实验证实了外排囊泡确实对布鲁氏菌的胞内增殖有促进作用。总之,本研究从宿主角度分析了汗液外泌体的蛋白质和mi RNA组,鉴定了汗液外泌体的生物标志物;同时从布鲁氏菌外膜囊泡角度,鉴定布鲁氏菌外膜囊泡蛋白质和小RNA表达谱,评估外膜囊泡对布鲁氏菌的侵染、胞内复制、分子互作和免疫调节的影响,为研究该菌的入侵、复制及与宿主的相互作用机制提供理论参考。