研究背景尿源性脓毒血症是经皮肾镜碎石术（Percutaneous Nephrolithotomy,PCNL）后常见的严重并发症,起病隐匿、进展迅速、病死率高、预后差。由于泌尿系结石疾病本身的特点及碎石术的特殊性,尿源性脓毒血症在发病前隐匿性极强,呈“爆发式”发病的特点,一旦发生,进展迅速,可在短短数小时内进展至感染性休克期甚至危及患者生命,有研究表明,针对该疾病的诊断和干预每延迟1h,患者的死亡率将会增加7.6%。据统计,经皮肾镜碎石术后尿源性脓毒血症的发生率为0.3～4.7%,伴随有高达30～40%的死亡率,尿源性脓毒血症越严重,死亡率也越高。尽管目前临床一线医生已给予了该疾病足够的重视,尿源性脓毒血症的发生率仍居高不下,严重制约着经皮肾镜碎石术的开展,成为了悬在医生和患者头上的一把危险利刃。鉴于此,及早的诊断和及时有效的干预治疗是减轻尿源性脓毒血症严重程度、降低术后死亡率、改善预后的关键,为此,我们应尽可能早地去预警和诊断尿源性脓毒血症的发生,并积极探索精准靶向和强有力的干预措施,来实现减轻炎性反应、控制病情进展、改善预后和降低病死率的目的。既往的研究和临床经验告诉我们,尿源性脓毒血症的发生常见于经皮肾镜碎石术后6h之内,因此,这要求我们去探索和发现术后早期即有显著变化以满足早期预警和诊断需求的炎性标志物。目前临床上常用到的血液炎性标志物包括白细胞（White blood cell,WBC）、中性粒细胞计数/占比、降钙素原（Procalcitonin,PCT）、C 反应蛋白（C-reactive protein,CRP）等尚不足以满足经皮肾镜碎石术后早期预警和诊断尿源性脓毒血症的需求。尿源性脓毒血症一旦发生后,一系列级联式的过激的全身炎性反应对机体的系统和器官产生影响,破坏组织和细胞,影响机体代谢,引起器官功能衰竭甚至死亡。针对该疾病的治疗目前集中于控制病原体的感染、充分的液体复苏、血管活性药物的应用和保护重要脏器功能等方面,我们可以看到,上述除控制感染以外的其他治疗措施主要作用于已出现的结果和损伤方面,相较于尿源性脓毒血症进展迅速的病情而言存在有很大的滞后性,因此,在寻找炎性标志物来早期预警和诊断尿源性脓毒血症的基础上,着眼于整个炎性反应介质网络的上游,探索和寻找精准靶向和强有力的干预措施去抑制过激的炎性反应从而减轻对机体的损伤,是我们需要思考和研究的问题,也将有可能会成为干预和治疗尿源性脓毒血症的新方向。白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）是由T淋巴细胞、B淋巴细胞、成纤维细胞、单核-巨噬细胞和内皮细胞等分泌的一种多效性趋化细胞因子,广泛地参与机体以炎性反应为代表的多种生理反应,当致病病原微生物入侵机体后,致病病原微生物及其产生的内毒素激活人体的免疫系统,触发一系列的级联反应,IL-6位于整个级联反应的上游,位居整个“炎症风暴”的中心,正常情况下人体内的含量极低,约为1～5pg/ml,一旦感染发生后IL-6反应异常迅速,水平迅速升高,感染发生后1h内即可有非常明显的升高,感染发生后2h即可达峰值,尤其在脓毒血症患者中将会有极大幅度的升高,在血浆中的半衰期仅为6h。立足于IL-6的生理代谢特征,我们确定经皮肾镜碎石术后2h作为IL-6的检验时间节点,理论上来讲是可以满足经皮肾镜碎石术后极早期预警和诊断尿源性脓毒血症的需要。当感染发生后,IL-6结合白细胞介素-6受体（Interleukin-6 receptor,IL-6R）后募集糖蛋白 130（Glycoprotein 130,gp130）,结合形成 IL-6/IL-6R/gp130六聚复合体,激活酪氨酸激酶（Janus kinase,JAK）/信号转导及转录激活因子（Signal transducer and activator of transcription,STAT）信号通路,磷酸化JAK形成p-JAK而活化,进而催化STAT3发生磷酸化作用形成p-STAT3而活化,活化的p-STAT3进入细胞核与相应的受体结合刺激靶向应答基因的转录表达,在炎症、细胞的增殖分化、血管生成、免疫调节和肿瘤的发生转移中发挥作用,基于此,我们致力于寻找一种IL-6的抑制剂来阻断JAK/STAT3信号通路,抑制JAK和STAT3的活化,进而抑制p-STAT3引起的相应靶向应答基因的转录表达,有望实现抑制过激的炎性反应、减轻对机体的损伤和改善预后的目的。本研究通过大肠杆菌刺激单核细胞的细胞实验和建立大鼠尿源性脓毒血症模型的动物实验,来研究IL-6的表达和其对JAK/STAT3信号通路的活化作用,以及IL-6抑制剂对JAK/STAT3信号通路的抑制作用,进而探索IL-6对尿源性脓毒血症的预警和诊断价值及其抑制剂对过激炎性反应的抑制作用,并结合临床实践来验证IL-6对尿源性脓毒血症的早期预警和诊断的作用及其临床应用价值,指导尿源性脓毒血症的早期预警、诊断和治疗。此外,本研究研发了一项新产品,即IL-6快速检测胶体金试纸条,并已完成产品的制作、性能检验和初步的临床验证工作。通过本研究,我们力求能为IL-6及其受体抑制剂早期预警、诊断和干预治疗尿源性脓毒血症提供有价值的理论依据、实验基础和数据支持。研究目的1.通过大肠杆菌刺激单核细胞来研究IL-6的表达和其对JAK/STAT3信号通路的激活作用,及IL-6抑制剂对JAK/STAT3信号通路的抑制作用。2.通过大鼠肾盂内注入大肠杆菌建立尿源性脓毒血症的动物模型,来探究IL-6对尿源性脓毒血症的早期诊断价值及其抑制剂对尿源性脓毒血症过激炎性反应的抑制作用。3.通过临床实践来验证IL-6对经皮肾镜碎石术后尿源性脓毒血症的早期预警和诊断的价值。4.通过临床实践来探索IL-6作为早期炎性标志物在经皮肾镜碎石术后尿源性脓毒血症中的临床应用价值。5.通过应用胶体金免疫层析技术来研制IL-6快速检测胶体金试纸条,为尿源性脓毒血症的诊断和救治提供更为便捷、迅速的手段。研究方法1.大肠杆菌刺激单核细胞表达IL-6激活JAK/STAT3信号通路及其抑制剂对JAK/STAT3信号通路抑制作用的研究1.1分离和培养大鼠外周血单核细胞取大鼠新鲜抗凝全血,等体积PBS稀释,大鼠外周血单核细胞分离液试剂盒进行处理和离心后吸取白色单核细胞层处理,单核细胞培养基进行贴壁培养,37℃、5%C02饱和湿度的细胞培养箱中进行传代培养。1.2 检测 IL-6、p-JAK、STAT3 和 p-STAT3取15个EP管,每3个EP管为一组,共五组,分别加入1mL浓度为1×106/mL的单核细胞悬液,实验组D组以单核细胞:大肠杆菌=1:10的比例加入大肠杆菌,实验组B组以单核细胞:大肠杆菌=1:10的比例加入大肠杆菌,并加入0.5μL的IL-6受体单克隆抗体托珠单抗,实验组C组以单核细胞:大肠杆菌=1:10的比例加入大肠杆菌,并加入80uM的JAK拮抗剂AG490,实验组E组以单核细胞:大肠杆菌=1:10的比例加入大肠杆菌,并加入0.5μL的IL-6受体单克隆抗体托珠单抗、80uM的JAK拮抗剂AG490和等体积的含10%胎牛血清的DMEM,对照组A组加入等体积的含10%胎牛血清的DMEM。静置反应6h后离心,分别收集上清液及细胞成分。（1）检测IL-6收集各组细胞上清液,应用ELISA法检测IL-6。（2）检测 p-JAK、STAT3 和 p-STAT3收集细胞样本,经胰蛋白酶溶液和细胞裂解液处理后,离心取上清液,应用Western Blotting 检测 p-JAK、STAT3 和 p-STAT3。2.IL-6对尿源性脓毒血症的早期预警、诊断及其抑制剂抑炎作用的研究2.1构建动物模型本研究通过肾盂内注入大肠杆菌构建大鼠尿源性感染的动物模型,SD大鼠,20只,随机分为四组,A组大鼠肾盂内注入生理盐水,B组大鼠肾盂内注入大肠杆菌（浓度2.0 × 108cfu/ml）,C组大鼠肾盂内注入大肠杆菌（浓度12.0×108cfu/ml）,D组大鼠肾盂内注入大肠杆菌（浓度12.0×108cfu/ml）及腹腔内注入IL-6受体单克隆抗体托珠单抗。2.2 24小时存活率观察和记录四组大鼠中每组大鼠的24小时存活率。2.3监测生命体征（1）动脉压:股动脉穿刺连接动脉压换能器监测动脉压。（2）体温:经肛门分别于术前、术后2h、术后4h、术后6h监测大鼠的体温。2.4血液炎性指标检测（1）检测白细胞计数经穿刺的股动脉分别于术前、术后2h、术后6h采血,采血后即可补回同等容量的生理盐水,血细胞自动计数仪检测白细胞计数。（2）检测 IL-6 和 PCT经穿刺的股动脉分别于术前、术后2小时、术后6小时采血,采血后即可补回同等容量的生理盐水,ELISA检测IL-6和PCT。2.5检测肝组织表达IL-6、STAT3和p-STAT3术后24h处死大鼠后,取肝脏组织应用PBS液冲洗3次,液氮辅助下研磨肝脏组织,RIPA裂解液裂解后离心,收集上清液,应用ELISA检测肝脏组织中IL-6的表达,Western Blotting检测肝脏组织中STAT3和p-STAT3的表达。2.6观察大鼠肺组织的切片术后24h处死大鼠,分离肺脏组织,取肺组织制备石蜡切片行HE染色评估肺脏炎性反应。3.IL-6对经皮肾镜碎石术后尿源性脓毒血症的早期预警和诊断的研究根据纳入和排除标准,我中心2019年4月至2019年9月入组患者90例,其中,16例发生术后尿源性脓毒血症患者纳入实验组1（EXP1 group,16）,74例未发生术后尿源性脓毒血症患者纳入对照组（CON group,74）,所有患者均执行标准化的手术路径（B超引导下的经皮肾镜碎石术）和标准化的抗感染治疗方案。收集和整理入组患者的性别、年龄、糖尿病、高血压、肾积水、结石负荷、尿培养、脓尿、手术时间和术后住院天数等数据,分别于术前、术后2h、术后1天和术后3天检测患者的白细胞、中性粒细胞占比、PCT和IL-6,进行统计分析。4.IL-6在经皮肾镜碎石术后尿源性脓毒血症中临床应用价值的研究根据纳入和排除标准,2019年4月至2019年9月共计16例患者发生经皮肾镜碎石术后尿源性脓毒血症,纳入实验组1（EXP1 group,16）,所有患者围手术期常规化验检测IL-6;2018年3月至2019年3月共计25例发生经皮肾镜碎石术后尿源性脓毒血症,纳入实验组2（EXP2 group,25）,所有患者围手术期未化验检测IL-6。所有患者均执行标准化的手术路径（B超引导下的经皮肾镜碎石术）和标准化的抗感染治疗方案,收集和整理入组患者的性别、年龄、糖尿病、高血压、肾积水、结石负荷、尿培养、脓尿、手术时间和术后住院天数等数据,记录患者自手术结束至给予临床干预治疗尿源性脓毒血症的时间,标记为术后干预时间,结合两组患者术后尿源性脓毒血症的严重程度,进行统计分析。5.IL-6快速检测胶体金试纸条的实验研制应用胶体金免疫层析技术来研制IL-6快速检测胶体金试纸条,我们采用柠檬酸三钠还原法来制备40nm的胶体金溶液,通过肉眼观察检测胶体金颗粒质量和利用紫外可见光吸收光谱计算自制胶体金颗粒的直径,采用盐析的方法确定自制胶体金颗粒的最佳标记pH和最佳标记蛋白量,制备胶体金标记物,包被硝酸纤维素膜,制备和处理样品垫,Tris-HCl缓冲液处理玻璃纤维膜,组装试纸条,制备IL-6的校准品并进而制备半定量比色卡,依次分别检测和验证试纸条的特异性、灵敏度、线性范围、稳定性和重复性,并通过临床样本检测进行初步的临床验证。6.统计分析我们使用SPSS 25.0对数据进行统计分析。分别依据数据类型选取相应的统计分析方法,其中,计量资料选用方差分析或t检验,以平均值±标准差来表示计量资料,计数资料选用卡方检验或Fish精确检验,P＜0.05表示差异具有统计学意义。实验结果1.1大肠杆菌刺激单核细胞高表达IL-6,激活JAK/STAT3信号通路,p-JAK和p-STAT3表达增加D组/单核细胞+大肠杆菌、C组/单核细胞+大肠杆菌+AG490、B组/单核细胞+大肠杆菌+托珠单抗、E组/单核细胞+大肠杆菌+托珠单抗+AG490较A组/单核细胞+DMEM表达IL-6水平显著升高,高表达的IL-6激活JAK/STAT3信号通路,催化JAK和STAT3磷酸化增加,p-JAK和p-STAT3表达增加。1.2抗IL-6R单克隆抗体通过阻断JAK/STAT3信号通路,抑制JAK和STAT3磷酸,抑制单核细胞表达IL-6B组/单核细胞+大肠杆菌+托珠单抗、C组/单核细胞+大肠杆菌+AG490、E组/单核细胞+大肠杆菌+托珠单抗+AG490较D组/单核细胞+大肠杆菌,STAT3水平无显著差异;托珠单抗和AG490阻断JAK/STAT3信号通路,抑制JAK和STAT3磷酸化,p-JAK和p-STAT3表达水平显著降低,且IL-6表达水平显著降低。2.1高表达的IL-6激活JAK/STAT3信号通路导致炎性反应加重（1）24小时大鼠存活率动物模型建立成功后,观察A组（生理盐水对照组）、B组（2.0×108cfu/ml大肠杆菌组）、C组（12.0×108cfu/ml大肠杆菌组）3组大鼠建模后24小时内的存活率,可见A组和B组5只大鼠全部存活（5/5）,C组5只大鼠仅有2只存活（2/5）。（2）生命体征监测①动脉压:监测A、B、C三组大鼠术前、术后2h、术后4h、术后6h的动脉压,其中,三组大鼠术前和术后2h的平均动脉压无明显差异;术后4h,C组大鼠的平均动脉压较A组和B组大鼠显著下降;术后6h,C组大鼠的平均动脉压较A组和B组大鼠显著下降。②体温:监测A、B、C三组大鼠术前、术后2h、术后4h、术后6h的体温,其中,三组大鼠的术前体温无明显差异;术后2h,C组大鼠的体温较A组和B组大鼠的体温显著升高;术后4h,C组和B组大鼠的体温较A组显著升高,且C组大鼠的体温显著高于B组大鼠的体温;术后6h,C组和B组大鼠的体温较A组显著升高,且C组大鼠的体温显著高于B组大鼠的体温。（3）血液炎性指标检测①白细胞计数:血细胞自动计数仪检测A、B、C三组大鼠术前、术后2h和术后6h的白细胞计数,其中,术前和术后2h各组间白细胞计数无明显差异;术后6h,C组大鼠较A组和B组大鼠的白细胞计数显著升高。②降钙素原:ELISA法检测A、B、C三组大鼠在术前、术后2h和术后6h各时间点的降钙素原,其中,术前各组间的降钙素原水平无明显差异;术后2h,B组和C组的降钙素原较A组降钙素原水平高,但B组和C组的降钙素原水平无明显差异;术后6h,B组和C组大鼠的降钙素原均较A组的降钙素原水平高,且C组的降钙素原水平高于B组的降钙素原水平。③白细胞介素-6:ELISA法检测A、B、C三组在术前、术后2h和术后6h各时间点的IL-6,其中,术前各组间的IL-6水平无明显差异;术后2h,C组的IL-6水平显著高于A组和B组的IL-6水平;术后6h,C组的IL-6水平显著高于A组和B组的IL-6水平。（4）大肠杆菌刺激肝脏组织高表达IL-6,催化JAK和STAT3磷酸化增加术后24h处死大鼠,取肝脏组织检测IL-6,大肠杆菌作用下刺激肝脏组织高表达IL-6,各组IL-6水平由高到低依次为C组＞B组＞A组,同等剂量大肠杆菌浓度越高,IL-6表达越高;IL-6通过JAK/STAT3通路催化JAK和STAT3磷酸化为p-JAK和p-STAT3,各组p-JAK和p-STAT3表达水平由高到低依次为C组＞B组＞A组,同等剂量大肠杆菌浓度越高,IL-6表达越高,JAK和STAT3磷酸化增加,p-JAK和p-STAT3表达越高。（5）大肠杆菌导致感染越重,肺部炎性反应越重大肠杆菌感染可诱发肺部的炎性反应,各组肺部的炎性反应由重到轻依次为C组＞B组＞A组,同等剂量大肠杆菌浓度越高,诱发的肺部炎性反应越重。2.2抗IL-6R单克隆抗体阻断JAK/STAT3通路,抑制过激的炎性反应（1）24小时大鼠存活率动物模型建立成功后,观察C组（12.0×108cfu/ml大肠杆菌组）和D组（12.0× 108cfu/ml大肠杆菌+托珠单抗组）大鼠建模后24小时内的存活率,可见D组5只大鼠全部存活（5/5）,C组5只大鼠仅有2只存活（2/5）。（2）生命体征监测①动脉压:C组和D组两组大鼠的术前和术后2h的平均动脉压无显著差异;术后4h,D组大鼠的平均动脉压显著高于C组大鼠的平均动脉压;术后6h,D组大鼠的平均动脉压显著高于C组大鼠的平均动脉压。②体温:C组和D组两组大鼠的术前和术后2h的平均体温无显著差异;术后4h,D组大鼠的平均体温显著低于C组大鼠的平均体温;术后6h,D组大鼠的平均体温显著低于C组大鼠的平均体温。（3）血液炎性指标检测①白细胞计数:血细胞自动计数仪检测C组和D组大鼠术前、术后2h和术后6h的白细胞计数,其中,术前和术后2h两组间白细胞计数无明显差异;术后6h,C组大鼠的白细胞计数较D组大鼠白细胞计数显著升高。②降钙素原:ELISA法检测C组和D组大鼠术前、术后2h和术后6h各时间点的降钙素原水平,其中,术前和术后2h两组间的降钙素原水平无显著差异;术后6h,D组的降钙素原水平显著低于C组的降钙素原水平。③白细胞介素-6:ELISA法检测C组和D组大鼠术前、术后2h和术后6h各时间点的IL-6,其中,术前和术后2h两组间的IL-6水平无显著差异;术后6h,C组的IL-6水平显著高于D组的IL-6水平。（4）抗IL-6R单克隆抗体阻断JAK/STAT3通路抑制JAK和STAT3磷酸化,抑制IL-6表达术后24h处死大鼠,取肝脏组织检测IL-6、STAT3和p-STAT3的表达,D组的IL-6水平显著低于C组的IL-6水平,抗IL-6R单克隆抗体托珠单抗抑制肝脏组织表达IL-6;C组和D组的STAT3的表达无显著差异,D组的p-JAK和p-STAT3表达显著低于C组的p-JAK和p-STAT3表达,抗IL-6R单克隆抗体托珠单抗通过结合IL-6R阻断JAK/STAT3信号通路,抑制JAK和STAT3的磷酸化即p-JAK和p-STAT3表达减少。（5）抗IL-6R单克隆抗体阻断JAK/STAT3通路减轻了肺部的炎性反应C组和D组接受同等的大肠杆菌感染,D组大鼠在抗IL-6R单克隆抗体作用下肺部的炎性反应显著减轻。3.IL-6早期预警和诊断经皮肾镜碎石术后尿源性脓毒血症3.1一般临床资料EXP1 group和CON group两组患者在性别、年龄、糖尿病、高血压、肾积水、结石负荷、尿培养、脓尿、手术时间方面差异无统计学意义;EXP1 group患者平均术后住院时间（5.56±1.41天）大于CON group患者平均术后住院时间（4.36±1.53天）,两组间差异有统计学意义。3.2炎性标志物（1）白细胞计数术后2h,EXP1 group和CON group两组间差异无统计学意义;术后1天,EXP1 group患者白细胞计数平均值显著高于CON group患者白细胞计数平均值;术后3天,EXP1 group患者白细胞计数平均值显著高于CON group患者白细胞计数平均值。（2）中性粒细胞占比（%）术后2h,EXP1 group患者平均中性粒细胞占比显著高于CON group患者平均中性粒细胞占比;术后1天,EXP1 group患者平均中性粒细胞占比显著高于CON group患者平均中性粒细胞占比。（3）PCT术后2h,EXP1 group和CON group两组间差异无统计学意义;术后1天,EXP1 group患者降钙素原平均值显著高于CON group患者降钙素原平均值;术后3天,EXP1 group患者降钙素原平均值显著高于CON group患者降钙素原平均值。（4）IL-6术后2h,EXP1 group患者IL-6平均值显著高于CON group患者IL-6平均值:术后1天,EXP1 group患者IL-6平均值显著高于CON group患者IL-6平均值。（5）诊断效能评估术后2h,ROC曲线显示术后2h不同炎性指标的AUC值由高到低依次为IL-6（AUC=1.000）,中性粒细胞占比（AUC=0.788）,PCT（AUC=0.719）,白细胞（AUC=0.511）;术后1天,ROC曲线显示术前不同炎性指标的AUC值由高到低依次为 IL-6（AUC=0.987）,PCT（AUC=0.932）,中性粒细胞占比（AUC=0.896）,白细胞（AUC=0.855）;术后3天,ROC曲线显示术前不同炎性指标的AUC值由高到低依次为PCT（AUC=0.954）,中性粒细胞占比（AUC=0.763）,白细胞（AUC=0.726）,IL-6（AUC = 0.656）。4.IL-6预警和诊断经皮肾镜碎石术后尿源性脓毒血症的临床应用价值4.1 一般临床资料EXP1 group和EXP2 group两组患者在性别、年龄、糖尿病、高血压、肾积水、结石负荷、尿培养、脓尿、手术时间方面的差异无统计学意义;4.2临床结果EXP1 group患者平均术后住院时间显著小于EXP2 group患者平均术后住院时间;EXP1 group患者平均术后干预时间显著小于EXP2 group患者平均术后干预时间;EXP1 group患者发生严重脓毒血症患者2例（2/16）,EXP2 group发生严重脓毒血症患者12例（12/25）,EXP1 group患者严重的脓毒血症发生率显著低于EXP2 group患者严重的脓毒血症发生率。5.研制IL-6快速检测胶体金试纸条应用胶体金免疫层析技术成功研制IL-6快速检测胶体金试纸条,并制备了半定量比色卡,经检测验证,该试纸条10min完成IL-6的半定量检测,特异性高,灵敏度为5pg/ml,具有良好线性关系的检测区间为5～2000pg/ml,并具有很好的稳定性和重复性,借助于体检样本评估试纸条的检测参考值为7pg/ml,炎性标本检测结果与临床验证结果具有很高的一致性。实验结论1.大肠杆菌刺激单核细胞高表达IL-6,激活JAK/STAT3信号通路,催化JAK和STAT3磷酸化,p-JAK和p-STAT3表达增加;托珠单抗通过结合IL-6R阻断JAK/STAT3信号通路,抑制JAK和STAT3的磷酸化,p-JAK和p-STAT3表达减少;托珠单抗抑制单核细胞表达IL-6。2.大鼠肾盂内注入浓度12.0×108cfu/ml的大肠杆菌可用于尿源性脓毒血症动物模型的构建;IL-6可用于早期预警和诊断尿源性脓毒血症;抗IL-6R单克隆抗体托珠单抗有效抑制机体过激的炎症反应。3.白细胞、中性粒细胞占比、PCT和IL-6在不同的时间节点具有不同的尿源性脓毒血症诊断价值,IL-6是早期预警和诊断尿源性脓毒症患者的高效能的炎性标志物。4.IL-6作为炎性标志物,可以提前进行干预治疗的时机,有利于减轻经皮肾镜碎石术后尿源性脓毒血症的严重程度、缩短术后住院时间和改善预后。5.IL-6快速检测胶体金试纸条制备和临床验证结果完成,检验便捷、迅速,现场操作,10min完成半定量检测,为脓毒血症危重患者的救治提供更多的时间和更好的时机。