论文部分内容阅读
肝细胞癌是全球癌症相关的第四大死亡原因,绝大多数的肝细胞癌患者病情出现反复并且5年生存率均低于10%。在治疗过程中肝细胞癌对放疗和化疗均不敏感,对于晚期病人来说长期以来都没有极有效治疗方法来提高生存率。2007年,索拉非尼被美国食品及药物管理局(FDA)批准为肝细胞癌唯一一线靶向治疗药物,可以使患者的中位生存期从7.9个月延长到10.7个月,平均增加了近3个月。索拉非尼是一种口服多重激酶抑制剂,能够抑制肿瘤细胞增殖、抑制血管生成和促进肿瘤细胞凋亡。索拉非尼的抗肿瘤作用主要是阻断生长因子信号,例如VEGFR、PDGFR以及下游的 RAF/MEK/ERK级联反应。索拉非尼能够通过降低Ras/Raf/MEK/ERK信号通路中的Raf1、B-Raf和激酶活性来抑制肿瘤细胞的增殖。索拉非尼还可以通过抑制肝细胞因子受体(c-Kit)、类Fms酪氨酸激酶(FLT-3)、血管内皮生长因子受体(VEGFR-2、VEGFR-3)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR-β)和其他酪氨酸激酶活性来抑制血管生成。此外,索拉非尼通过减少肿瘤细胞中e1F4E磷酸化表达和Mcl-1表达,从而促使细胞发生凋亡。索拉非尼能够有效延长肝细胞癌患者的中位生存时间,但是仅为3个月,绝大多数患者因产生耐药性导致肝癌复发和死亡,而且在治疗过程中会伴有严重的副作用。通过索拉非尼药物处理后引起多种副作用主要是在胃肠道、体质和皮肤病学方面。索拉非尼的耐药机制一般分为原发性耐药与获得性耐药。由于肝细胞癌具有遗传异质性,有些肝癌病人在未接受索拉非尼治疗之前就对其产生耐药性,这种耐药性就被称为原发性耐药。原发性耐药机制主要涉及EGFR过表达与Ras/Raf/MEK/ERK通路异常激活。获得性耐药是指治疗患者初期对靶向药物治疗响应良好,随着药物治疗时间增加而导致治疗效果降低。索拉非尼获得性耐药机制涉及到分子水平、细胞水平和组织微环境等多层面的调控,例如PI3K/Akt通路、EMT、缺氧微环境、表观遗传调控等。索拉非尼治疗肝癌产生的副作用以及耐药性制约着索拉非尼的治疗效果,深入研究索拉非尼治疗过程中肝细胞癌产生耐药的分子机制,寻找索拉非尼的联合靶向策略,对于寻找以索拉非尼为基础的联合靶向治疗、提高晚期肝癌治疗效果有重要的意义。一、研究目的本研究明确索拉非尼在治疗肝细胞癌过程中耐药现象产生进程和机制,探讨PRMT5在索拉非尼耐药过程中的作用,同时探讨PRMT5抑制剂与索拉非尼联合使用对肝细胞癌的治疗效果,为解决索拉非尼耐药和肝癌治疗提供新的策略。二、研究方法1.裸鼠移植瘤模型探究肝细胞癌索拉非尼耐药发生的过程和信号通路改变。运用裸鼠移植瘤模型,通过H&E染色和免疫组化染色,了解索拉非尼耐药过程中肿瘤损伤情况,pErk、Ki67、pMLKL、PRMT5等分子的表达情况。2.体外细胞培养模型研究肝细胞癌索拉非尼耐药发生过程和信号通路改变。建立sorafenib耐药细胞模型,选择经过索拉非尼处理的不同时间点样品,提取总蛋白进行Western Blotting。3.通过CCK-8实验,研究索拉非尼与PRMT5抑制剂HLCL联合使用对肝癌细胞活力的影响。4.通过克隆形成实验,研究索拉非尼与PRMT5抑制剂HLCL联合使用对肝癌细胞克隆形成能力的影响。5.通过流式细胞技术检测细胞周期、qPCR检测细胞周期与细胞增殖相关基因表达,探讨索拉非尼与PRMT5抑制剂HLCL联合使用对肝癌细胞周期的影响。6.通过流式细胞技术研究细胞死亡、Western Blotting检测细胞周期、细胞坏死以及其他信号通路的相关蛋白表达,探讨索拉非尼与PRMT5抑制剂联合使用对肝癌细胞的作用机制。三、实验结果1.索拉非尼处理7天后肿瘤体积减少,免疫组化显示坏死区域增加,pErk、Ki67表达量减少,PRMT5、pMLKL表达量增加;索拉非尼处理40天之后,肿瘤开始恢复生长,免疫组化显示坏死区域减少,pErk、Ki67和PRMT5表达量增加,pMLKL表达量减少。2.细胞模型中PRMT5表达量增加,且早于pErk的反馈激活,说明PRMT5表达量增加很可能参与了肝癌细胞索拉非尼耐药性的形成。3.索拉非尼与PRMT5抑制剂HLCL联合使用影响肝癌细胞活力:通过CCK-8实验结果表明,索拉非尼与PRMT5抑制剂联合使用表现出协同效果,有效地抑制肝癌细胞活力。4.索拉非尼与PRMT5抑制剂HLCL联合使用抑制肝癌细胞克隆形成能力。5.索拉非尼与PRMT5抑制剂HLCL联合使用相对于索拉非尼单独使用没有进一步影响细胞周期。6.索拉非尼与PRMT5抑制剂HLCL联合使用导致肝癌细胞死亡。四、结论及创新性1.在索拉非尼耐药过程当中PRMT5表达量升高,揭示了索拉非尼获得性耐药与PRMT5异常表达有关。2.发现了 PRMT5在索拉非尼获得性耐药中的作用和机制PRMT5异常表达可引起pErk反馈激活,PRMT5异常表达很可能参与了肝癌细胞索拉非尼耐药性的形成。3.为肝细胞癌提供更有效的治疗方法索拉非尼与PRMT5抑制剂联合使用可以增强索拉非尼对肝细胞癌的杀伤作用,为临床上索拉非尼与PRMT5抑制剂联合用药治疗肝细胞癌提供理论基础。