百合AG类基因的同源克隆和分析

来源 :南京林业大学 | 被引量 : 8次 | 上传用户:HC_luopo
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百合花姿优美,是世界鲜切花市场的五大主要产品之一。但在营销和消费过程中,花粉污染衣物和其他一些有价值的物品一直是一个缺憾。因此,通过调控百合花发育相关基因的表达,调控形态发生,改变百合的花器官的结构是近年花卉育种学家探索的重要领域。本研究基于这一基本目标,进行了百合花器官发育基因调控有关的基础研究,并对分子生物学的实验方法进行了改进。主要结论如下: 从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的重要前提。百合的植物组织中富含多糖,多糖的许多理化性质与RNA很相似,因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携去除,造成RNA产量的减少,这就使得提取百合的RNA比较困难。本试验采用了五种方法(CTAB法、TRIZOL法、WI法、GT法和TRIS-SDS法),对三个百合种试验材料(鲜切花、卷丹、麝香百合)进行了研究。鲜切花为市售东方百合产品,购回后用液氮冷萃后,-70℃保存备用。卷丹和麝香百合为实验室种质资源圃中收集的材料,开花时直接从植株上采下,于液氮冷萃后,-70℃保存备用。 试验结果显示,CTAB、TRIZOL和WI法均不适合百合RNA的提取,TRIZOL法虽然操作简单,步骤少,但是得到的RNA不纯;CTAB法用于提取鲜切花根本提取不到RNA,用于提取卷丹和麝香百合时,也出现不同程度的降解;GT法虽然适合百合的提取,但是操作复杂,而且得到的RNA含量不高,效率很低。TRIS-SDS法既能提取到高质量的RNA,也能高效提取,并对不同品种的百合有普遍的通用性。经过改进的TRIS-SDS法,操作也比较简便,试验中一些试剂都可以自己配制,降低了试验费用。 参照单子叶植物的AG类基因序列设计简并引物,利用RT-PCR的方法,从百合中扩增AG到同源片段,并根据扩增出的片段序列设计特异引物进行5’RACE和3’RACE的扩增,最终获得全长。本试验从百合中克隆得到了2个近全长的花发育相关基因片段LLAGM 1,2,它们都属于MADSbox基因家族,并和AG类基因有较高的同源性。 LLAGM1全长1000bp,编码243个氨基酸。LLAGM1的氨基酸序列与拟南芥AG的同源性为68.5%,与榛子CaMADS1的同源性为68.5%,与风信子HAG的同源性为73%,与百合LLAG1同源性为92.2%,与水稻OsMADS3的同源性为68.2%,与姬蝴蝶兰PeMADS1的同源性为71%,与矮牵牛pMADS3的同源性为68.8%。氨基酸序列比较可以看出,LLAGM1和LLAG1的M区完全相同,但是在K区存在18个不同的氨基酸序列,在C端有两个不同的氨基酸。 LLAGM2全长1168bp,编码249个氨基酸。LLAGM2与多种植物的AG类基因同源性较高。LLAGM1的氨基酸序列与拟南芥AG的同源性为64.1%,与榛子CaMADS1的同源性为64.6%,与风信子HAG的同源性为6..6%,与百合LLAG1同源性为86.5%,与水稻OsMADS3的同源性为63.6%,与姬蝴蝶兰PeMADS1的同源性为68%,与矮牵牛pMADS3的同源性为65.3%。LLAGM2与LLAG1在K区有20个氨基酸不同,C末端也有较大差异。 LLAGM1和LLAGM2基因片段全长的K区和C区末端的这种差异,对于百合花发育的功能有待今后进一步深入研究。
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