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侵袭性和转移性是恶性肿瘤最重要的特征,也是肿瘤患者死亡的主要原因,目前已证实肿瘤转移是基因调控下的多阶段、多因素、多步骤的过程,肿瘤侵袭转移的研究虽然有了长足的发展,但其分子机制远远没有阐明。因此研究发现并证实与肿瘤转移过程高度相关的基因,深入了解这些基因在肿瘤转移过程中的作用及机制仍是研究热点。囊泡膜结合蛋白相关蛋白VAP33是一类特殊的蛋白,分为VAPA,VAPB,VAPC三个亚型,通过与VAMP (vesicle associated membrane protein)结合发挥囊泡运输作用。本实验室前期工作,在基因和蛋白水平证实VAP33的表达程度跟肿瘤细胞的肺转移能力呈正相关;Pastric.S也发现肺转移癌组织较原发癌中VAPA高表达作为一种调节囊泡运输的蛋白,VAP33在肿瘤细胞生物学及肿瘤转移中的作用及机制鲜有报道。本研究在参考前期工作及相关文献的基础上,进一步探讨VAP33在肿瘤恶性行为发生中的作用。本研究采用了具有低转移特性的两个细胞株:小鼠树突状肉瘤细胞DG6和小鼠肺腺癌细胞LA1作为体外模型,通过建立稳定过表达VAP33蛋白的细胞株(DG6-VAP33、LA1-VAP33)来观察细胞的变化。首先,本研究构建了表达VAP33-GFP融合蛋白的表达载体、建立了DG6-VAP33和LA1-VAP33细胞株。根据Gene Bank中VAP33的mRNA序列设计一对引物,在正反引物的5’端分别加入Pmel和Mlul酶切位点及保护碱基。通过RT-PCR技术从DCS细胞的cDNA中扩增出VAP33,利用基因重组技术,将目的基因克隆到载体pWPXL的Pmel/Mlul酶切位点之间,构建重组载体,经测序该载体构建成功.之后本研究采用慢病毒包装技术,将重组病毒质粒(pWPXL-VAP33)与两种包装质粒(PsPAX2、MD2G)在脂质体Lipofectamine2000介导下共转染293T细胞(人胚肾细胞),包装出重组慢病毒,分别以不同的MOI值感染目的细胞。通过荧光显微镜挑选,WB鉴定获得VAP33稳定过表达细胞株(DG6-VAP33和LA1-VAP33)。接下来本研究又观察VAP33过表达对恶性肿瘤细胞生物学特性的影响。本研究检测了肿瘤细胞在形态、体积、增殖、集落形成、运动和侵袭能力方面的改变,同时设立DG6、LA1细胞为对照组。细胞分析计数仪CasyTT检测细胞大小,DG6和DG6-VAP33细胞的平均直径分别为16.58μm和15.79μm,细胞大小无明显变化;核浆比分别为1:4.66(DG6)和1:3.99(DG6-VAP33);通过显微镜观察,过表达前后的DG6细胞形态也无明显变化;DG6-VAP33和LA1-VAP33集落数分别为(36+5)个/孔和(21±3)个/孔,低于其对照组(52±8)个/孔和(28+4)/孔,P<0.05,说明VAP33抑制肿瘤细胞体外增殖能力;划痕实验显示VAP33与DG6细胞体外运动能力没有明显关系;transwell方法观察到,DG6-VAP33田胞体外侵袭能力显著下降,穿膜细胞数(28±22)少于DG6(72±34),P<0.01,而LA1-VAP33体外侵袭能力无明显改变,说明VAP33与肿瘤细胞侵袭能力的关系需更多实验研究确定。以上结果说明,VAP33过表达降低了肿瘤细胞的体外增殖能力。为进一步明确过表达VAP33在体内水平上对恶性肿瘤的作用,本研究建立了小鼠皮下移植瘤模型,观察该蛋白对肿瘤细胞体内增殖、成瘤、转移能力的影响。结果显示,DG6-VAP33组肿瘤生长速度显著慢于DG6组;成瘤率(5/10,50%)、肺转移率(0)也明显降低(DG6组成瘤率100%、肺转移率80%)。说明过表达VAP33蛋白可以有效抑制DG6细胞在体内的增殖、成瘤、转移能力。总之,本研究证明过表达VAP33可抑制肿瘤细胞的体内外增殖,抑制肿瘤细胞的转移。