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研究目的:
柯萨奇B组病毒（Coxsackievirus B,CV-B）分为6个血清型，CV-B组病毒分布较广泛，人类感染的机会较大，病毒进入人体后在特定的组织或器官内进行复制，致使心脏、胰腺、肌肉、骨骼发生病变。柯萨奇B组4型（Coxsackievirus B4,CV-B4）是CV-B组病毒中较为常见及典型的病毒。有研究表明CV-B4病毒是在婴幼儿时期引起胰岛素依赖性糖尿病的主要致病因素之一，另外还可导致新生儿感染心肌炎和脑炎。与其他肠道病毒相比，CV-B4病毒的致死率较高。
目前，尚无防控CV-B4感染的疫苗，缺乏高效的治疗药物。当前，基因工程疫苗研发技术的愈加成熟，相较于传统灭活疫苗具备更好的安全性。考虑到对CV-B4疫苗需求的提高，在本研究中，针对构建的以水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）为载体的CV-B4疫苗，通过WesternBlot及间接免疫荧光验证重组疫苗的蛋白表达水平，并利用建立的BALB/c乳鼠的CV-B4感染模型，与传统CV-B4灭活疫苗比较，进一步评价该CV-B4基因工程疫苗对乳鼠的保护效果，以期为CV-B4病毒的预防控制提供更安全高效的疫苗，降低CV-B4病毒的感染率。
本实验针对以VSV为载体所构建的含CV-B4分离株LY114F VP1片段的重组载体疫苗VSV-VP1，经WesternBlot及间接免疫荧光验证了重组疫苗的成功构建。并且，基于前期建立的CV-B4动物感染模型，对比VSV-VP1疫苗滴鼻免疫、皮下免疫及CV-B4灭活疫苗皮下免疫后，BALB/c成年鼠体内产生的IgG和IgA含量、免疫BALB/c孕鼠后仔鼠的存活率、组织病理学变化及体内细胞因子的表达水平，评价CV-B4基因工程苗和传统灭活疫苗的免疫保护效果，以期为预防CV-B4感染的疫苗选择及应用提供参考。
研究方法:
1.CV-B4分离株的准备及体内致病性
提取患儿粪便中病毒总RNA，进行CV-B4病毒的初步鉴定并测序。对CV-B4鉴定阳性的样本，经Vero细胞进行增殖培养，测定病毒载量。选取的1日龄BALB/c乳鼠经肌肉注射途径感染107TCID50/只的CV-B4病毒液，通过动物存活率和临床评分，分析CV-B4病毒的体内致病性。将CV-B4病毒液注射于成年雄性BALB/c鼠体内，观察成年鼠的血糖及糖耐量变化。
2.VSV-VP1重组疫苗VP1蛋白的表达验证
为验证VSV-VP1重组疫苗蛋白VP1蛋白是否正确表达，进行了两部分实验进行验证：Western Blot检测及间接免疫荧光。将包被有CV-B4VP1的VSV-VP1重组疫苗感染Vero细胞，CV-B4病毒液为对照收集细胞液进行SDS-PAGE凝胶电泳，WesternBlot验证比较重组疫苗中CV-B4VP1和CV-B4目的蛋白的大小；用VSV-VP1感染Vero细胞，CV-B4多抗血清孵育，DAPI染色，在荧光显微镜下观察CV-B4VP1蛋白是否已正常表达。
3.VSV-VP1免疫效果与灭活CV-B4疫苗的免疫效果比较
将BALB/c雄性成年鼠随机分为4组，即CV-B4灭活免疫组、VSV-VP1皮下免疫组、VSV-VP1滴鼻免疫组、空白对照组，每只小鼠等剂量免疫。免疫后0w、1w、2w、3w、4w、5w、6w取小鼠眼球血离心收集血清用来检测IgG含量,同时收集小鼠粪便测IgA含量。
为进一步验证两种疫苗的免疫效果，进行了母传抗体保护实验。选取刚怀孕的成年雌性鼠随机分为5组，分别为CV-B4灭活组、VSV-VP1滴鼻免疫组、VSV-VP1皮下免疫组、阴性对照组及空白对照组。对照组孕鼠等剂量注射PBS。对生产的一日龄乳鼠，等剂量肌肉注射CV-B4病毒液。每天记录乳鼠体重及临床症状。显微镜检乳鼠组织的病理学变化。通过ELISA法检测乳鼠感染CV-B4病毒后第1、3、5天的心脏血，4℃过夜静置后离心取上清，测血浆中细胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表达水平，以初步了解上述细胞因子在CV-B4感染中可能发挥的作用。
研究结果:
1.经SDS-PAGE凝胶电泳显示，VSV-VP1疫苗所包被的CV-B4VP1蛋白已成功表达。同时，间接免疫荧光试验也观察到了CV-B4VP1蛋白表达的荧光信号。
2.对比VSV-VP1基因工程疫苗和CV-B4灭活疫苗对成年鼠的免疫结果显示，VSV-VP1滴鼻免疫在免疫一次后产生的IgG含量较VSV-VP1重组疫苗、CV-B4灭活疫苗产生的IgG含量高。
3.VSV-VP1基因工程疫苗和CV-B4灭活疫苗的母传抗体保护实验中取乳鼠心脏、肺、后肢肌、脑做HE染色，结果显示CV-B4病毒对脑、肌肉的损伤较大，主要引起脑、后肢肌出现淋巴细胞浸润、水肿及纤维组织增生，并且出现肌束断裂。阳性对照组脑显示神经元变性坏死、基质炎性水肿并伴有脑室脉络丛大量淋巴细胞浸润现象。
4.血浆中细胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的检测结果表明：VSV-VP1滴鼻免疫组各组细胞因子的均值均小于VSV-VP1皮下免疫组、CV-B4灭活组及阳性对照组，且差异有统计学意义。
研究结论:
1.选取的1日龄BALB/c乳鼠，经肌肉注射途径感染107TCID50/只的CV-B4病毒液，乳鼠感染后3天，出现中枢神经系统症状典型、起病时间稳定及致死率高为特点的CV-B4感染模型；
2.通过WesternBlot及间接免疫荧光的结果显示，VSV-VP1包被的CV-B4VP1片段得到了成功表达；
3.经滴鼻免疫和皮下免疫VSV-VP1疫苗及经皮下免疫灭活CV-B4疫苗对乳鼠的免疫效果均由不同程度的保护作用，尤其是经滴鼻免疫的VSV-VP1疫苗，一次免疫后便对机体产生较强的免疫作用。母传抗体保护实验研究结果表明,滴鼻免疫VSV-VP1疫苗的保护作用较好。
综合以上研究结果，表明以VSV为载体构建的CV-B4基因工程疫苗具备安全高效的免疫保护效果，在今后将具备更广阔的发展前景。
柯萨奇B组病毒（Coxsackievirus B,CV-B）分为6个血清型，CV-B组病毒分布较广泛，人类感染的机会较大，病毒进入人体后在特定的组织或器官内进行复制，致使心脏、胰腺、肌肉、骨骼发生病变。柯萨奇B组4型（Coxsackievirus B4,CV-B4）是CV-B组病毒中较为常见及典型的病毒。有研究表明CV-B4病毒是在婴幼儿时期引起胰岛素依赖性糖尿病的主要致病因素之一，另外还可导致新生儿感染心肌炎和脑炎。与其他肠道病毒相比，CV-B4病毒的致死率较高。
目前，尚无防控CV-B4感染的疫苗，缺乏高效的治疗药物。当前，基因工程疫苗研发技术的愈加成熟，相较于传统灭活疫苗具备更好的安全性。考虑到对CV-B4疫苗需求的提高，在本研究中，针对构建的以水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）为载体的CV-B4疫苗，通过WesternBlot及间接免疫荧光验证重组疫苗的蛋白表达水平，并利用建立的BALB/c乳鼠的CV-B4感染模型，与传统CV-B4灭活疫苗比较，进一步评价该CV-B4基因工程疫苗对乳鼠的保护效果，以期为CV-B4病毒的预防控制提供更安全高效的疫苗，降低CV-B4病毒的感染率。
本实验针对以VSV为载体所构建的含CV-B4分离株LY114F VP1片段的重组载体疫苗VSV-VP1，经WesternBlot及间接免疫荧光验证了重组疫苗的成功构建。并且，基于前期建立的CV-B4动物感染模型，对比VSV-VP1疫苗滴鼻免疫、皮下免疫及CV-B4灭活疫苗皮下免疫后，BALB/c成年鼠体内产生的IgG和IgA含量、免疫BALB/c孕鼠后仔鼠的存活率、组织病理学变化及体内细胞因子的表达水平，评价CV-B4基因工程苗和传统灭活疫苗的免疫保护效果，以期为预防CV-B4感染的疫苗选择及应用提供参考。
研究方法:
1.CV-B4分离株的准备及体内致病性
提取患儿粪便中病毒总RNA，进行CV-B4病毒的初步鉴定并测序。对CV-B4鉴定阳性的样本，经Vero细胞进行增殖培养，测定病毒载量。选取的1日龄BALB/c乳鼠经肌肉注射途径感染107TCID50/只的CV-B4病毒液，通过动物存活率和临床评分，分析CV-B4病毒的体内致病性。将CV-B4病毒液注射于成年雄性BALB/c鼠体内，观察成年鼠的血糖及糖耐量变化。
2.VSV-VP1重组疫苗VP1蛋白的表达验证
为验证VSV-VP1重组疫苗蛋白VP1蛋白是否正确表达，进行了两部分实验进行验证：Western Blot检测及间接免疫荧光。将包被有CV-B4VP1的VSV-VP1重组疫苗感染Vero细胞，CV-B4病毒液为对照收集细胞液进行SDS-PAGE凝胶电泳，WesternBlot验证比较重组疫苗中CV-B4VP1和CV-B4目的蛋白的大小；用VSV-VP1感染Vero细胞，CV-B4多抗血清孵育，DAPI染色，在荧光显微镜下观察CV-B4VP1蛋白是否已正常表达。
3.VSV-VP1免疫效果与灭活CV-B4疫苗的免疫效果比较
将BALB/c雄性成年鼠随机分为4组，即CV-B4灭活免疫组、VSV-VP1皮下免疫组、VSV-VP1滴鼻免疫组、空白对照组，每只小鼠等剂量免疫。免疫后0w、1w、2w、3w、4w、5w、6w取小鼠眼球血离心收集血清用来检测IgG含量,同时收集小鼠粪便测IgA含量。
为进一步验证两种疫苗的免疫效果，进行了母传抗体保护实验。选取刚怀孕的成年雌性鼠随机分为5组，分别为CV-B4灭活组、VSV-VP1滴鼻免疫组、VSV-VP1皮下免疫组、阴性对照组及空白对照组。对照组孕鼠等剂量注射PBS。对生产的一日龄乳鼠，等剂量肌肉注射CV-B4病毒液。每天记录乳鼠体重及临床症状。显微镜检乳鼠组织的病理学变化。通过ELISA法检测乳鼠感染CV-B4病毒后第1、3、5天的心脏血，4℃过夜静置后离心取上清，测血浆中细胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表达水平，以初步了解上述细胞因子在CV-B4感染中可能发挥的作用。
研究结果:
1.经SDS-PAGE凝胶电泳显示，VSV-VP1疫苗所包被的CV-B4VP1蛋白已成功表达。同时，间接免疫荧光试验也观察到了CV-B4VP1蛋白表达的荧光信号。
2.对比VSV-VP1基因工程疫苗和CV-B4灭活疫苗对成年鼠的免疫结果显示，VSV-VP1滴鼻免疫在免疫一次后产生的IgG含量较VSV-VP1重组疫苗、CV-B4灭活疫苗产生的IgG含量高。
3.VSV-VP1基因工程疫苗和CV-B4灭活疫苗的母传抗体保护实验中取乳鼠心脏、肺、后肢肌、脑做HE染色，结果显示CV-B4病毒对脑、肌肉的损伤较大，主要引起脑、后肢肌出现淋巴细胞浸润、水肿及纤维组织增生，并且出现肌束断裂。阳性对照组脑显示神经元变性坏死、基质炎性水肿并伴有脑室脉络丛大量淋巴细胞浸润现象。
4.血浆中细胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的检测结果表明：VSV-VP1滴鼻免疫组各组细胞因子的均值均小于VSV-VP1皮下免疫组、CV-B4灭活组及阳性对照组，且差异有统计学意义。
研究结论:
1.选取的1日龄BALB/c乳鼠，经肌肉注射途径感染107TCID50/只的CV-B4病毒液，乳鼠感染后3天，出现中枢神经系统症状典型、起病时间稳定及致死率高为特点的CV-B4感染模型；
2.通过WesternBlot及间接免疫荧光的结果显示，VSV-VP1包被的CV-B4VP1片段得到了成功表达；
3.经滴鼻免疫和皮下免疫VSV-VP1疫苗及经皮下免疫灭活CV-B4疫苗对乳鼠的免疫效果均由不同程度的保护作用，尤其是经滴鼻免疫的VSV-VP1疫苗，一次免疫后便对机体产生较强的免疫作用。母传抗体保护实验研究结果表明,滴鼻免疫VSV-VP1疫苗的保护作用较好。
综合以上研究结果，表明以VSV为载体构建的CV-B4基因工程疫苗具备安全高效的免疫保护效果，在今后将具备更广阔的发展前景。