由野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种Xanthomonas campestrts pv. campestris(Xcc)引起的黑腐病(Black rot)是世界范围内花椰菜生产的主要病害之一，该病原菌能感染所有十字花科植物，尤其对甘蓝类(Brassica oleracea)蔬菜的生产是破坏性的，导致产量和品质大幅下降。目前尚无行之有效的防治方法。从分子水平上研究花椰菜抗黑腐病的机制，对花椰菜的生产及育种实践具有重要的理论和现实意义。本研究以花椰菜抗、感黑腐病的近等位基因系C712和C731为材料，利用抑制性消减杂交(SSH)技术和Operon公司的拟南芥寡核苷酸芯片，分离和检测抗病品系C712在Xcc胁迫后的差异表达基因，并对部分差异表达基因进行转基因功能分析，初步揭示了Xcc诱导的抗性相关基因的种类和数量及其参与的代谢和信号传导途径，为深入研究花椰菜抗黑腐病的机制及利用抗性资源进行抗病品种选育和改良奠定了基础。主要研究结果如下：　　 1．将田间采集的花椰菜典型黑腐病病样经分离、纯化后，从形态、生理生化及分子方面进行了鉴定和回接鉴定，确定了所分离的病原菌为花椰菜黑腐病的致病菌-野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种。　　 2．建立优化了花椰菜黑腐病苗期人工接种的方法，即接种方法为针刺法，接种时期为4-5叶期，接种菌液浓度为1.0x108cfu/mL，环境温度控制在25℃-30℃，病程为14d。　　 3．分别以花椰菜抗、感黑腐病的近等位基因系C712和C731为“Tester”和“Driver”，利用SSH技术构建了Xcc诱导的包含1，476个阳性克隆的正向消减cDNA文库。利用反向Northern杂交技术从阳性克隆中筛选出280个Xcc诱导上调表达的克隆，测序后得到202条单一序列(unigene)。Blast分析结果表明182个unigenes与NCBI中已知基因高度同源，占全部非重复序列的90.1％。按MIPS的分类方法对已知功能基因进行功能分类，发现这些差异表达基因的功能主要涉及物质及能量代谢、信号传导、转录调控、苯丙烷代谢途径及防卫反应等。另有20条unigenes在GenBank中没有查到对应的同源序列，可能为新基因。　　 4．采用Operon公司的拟南芥70mer寡核苷酸芯片，以接种Xcc Oh的叶片为对照，分析了花椰菜抗病系C712在Xcc接种后24h的基因表达谱差异。在29，110个探针中，共检测到10，004个表达位点，占芯片总位点数的34.4%，有效差异表达Ratio值≥2或≤0.5的基因共1，629个，其中上调表达基因1，010个，下调表达基因619个。选取30个参与不同代谢途径的上调和下调基因进行实时荧光定量PCR验证，结果表明，拟南芥70mer寡核苷酸芯片能较真实地反映花椰菜在Xcc胁迫后部分基因表达水平的变化，说明拟南芥70mer寡核苷酸芯片可用于花椰菜基因差异表达的研究。通过Gene ontology(GO)对差异表达基因进行功能分类，发现差异表达基因在抗病过程中参与不同生理代谢途径，这些基因的功能主要涉及防御反应、细胞信号传导、基因转录等，推测花椰菜对Xcc的抗性是由多基因参与的多种代谢途径协同作用的结果。　　 5．在抗病系C712接种Xcc后24h，大量与植物系统获得抗性（SAR）有关的基因上调表达，表明SAR在花椰菜抗黑腐病的过程中可能起到了重要的作用。同时还检测到大量参与SA、Et和JA信号传导途径的基因上调表达，表明这3个途径均参与了花椰菜对Xcc的防御反应。特别是JA/Et共同诱导的CEJ1和PDFl.2上调表达，说明JA/Et共同诱导的植物信号传导途径参与了花椰菜对Xcc的防御反应，JA/SA共同诱导的PAL基因上调表达，说明防御反应中可能还存在JA/SA共同诱导的信号途径。　　 6．差异表达基因的KOBAS分析结果显示，花椰菜在Xcc胁迫下参与苯丙烷代谢途径的多个关键基因均上调表达，如4CL，CAD，CYP450，PAL等，表明该代谢途径可能是花椰菜对Xcc防御机制的基础。　　 7．根据抑制性消减cDNA文库和拟南芥寡核苷酸芯片所得差异表达序列的功能注释，挑选18个可能与抗性相关的基因(AIG、APX1、CHI、CaR、CYP450、CHS、PDFl.2、GSH-Px、GST, LTP、 MPK4、PAL、PGIPl、Proteinase inhibitor14、RubisCO，TLP，Trh、WRKY11)，利用实时荧光定量PCR对其在抗、感病花椰菜中的表达模式进行分析，结果表明，这些基因在花椰菜叶片中均为组成型表达，在Xcc胁迫后，无论是抗病品系还是感病品系这些基因的表达都发生变化，但在抗、感病花椰菜中具有明显不同的表达模式，多数基因在抗病花椰菜中对Xcc的响应要早于感病花椰菜，并且在表达水平上抗病花椰菜也高于感病花椰菜。　　 8．采用RT-PCR技术从抗病花椰菜中克隆出BoMPK3、BoMPK4、BoWRKY11、BoPAL、BoTLP、BoAPXl, BoAPX2、BonsLTP、BoTrxh、BoPDFl.2、BoPGIPl、BoCHS等在抗、感病材料中表达模式存在差异的基因的编码序列，生物信息学分析表明，这些基因与植物抗病性存在一定的关系。　　 9．为了进一步研究BoMPK3、BoMPK4、Bo WRKY11、BoPAL、BoTLP、BoAPX1、BonsLTP、BoTrx、BoPDF1.2、BoPGIP1、BoCHS等基因与花椰菜黑腐病抗性之间的关系，明确其在花椰菜抗黑腐病方面的作用，构建了植物表达载体pX6-BoMPK3、pB1101-BoMPK4、pX6-BoWRKY11、 pX6-BoPAL、 pBI21-BoTLP、pRI101-BoAPX1、pX6-BoAPX2,pBI121-BonsLTP、pRI101-BoTrx h、pBI121-BoPDF1.2、pBI121-BoCHS)。采用农杆菌介导法将BoWRKYl1、BoPAL、BonsL TP、Bo Trxh、BoPDF1.2等5个基因转化花椰菜感病系C731，获得了卡那霉素抗性转化株系。采用人工接种的方法对转化植株进行黑腐病抗病性鉴定，结果表明，转PAL基因的花椰菜抗病性明显增强，说明PAL在花椰菜抗黑腐病过程中起一定的积极作用，并且PAL参与的苯丙烷代谢途径可能在花椰菜抗黑腐病的过程中起重要作用。　　 综上所述，花椰菜对Xcc的抗性是通过多种代谢及信号传导途径实现的，是多基因共同的作用结果，而且各防御途径间不是孤立的，存在着各种形式的相互作用，有重叠也有交叉，并以此为基础形成了由不同形式的抗性信号传导途径组成的复杂的防御网络，以此来精确调控花椰菜对Xcc的抗性反应。单条途径的加强都会对其它途径造成拮抗，都会使花椰菜的抗病性减弱，只有各条途径相互协调，才能发挥最大的抗性。