枸杞是我国重要的植物资源，尤其以宁夏枸杞最为著名。现代医学临床研究认为，从枸杞中提取的枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides, LBPs)是枸杞生物学作用的主要有效成份之一，它由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖和木糖等6种单糖组成。枸杞多糖具有延缓衰老，抗氧化；抗肿瘤，促进肿瘤细胞凋亡；降血糖，降血脂；免疫调节和抗辐射等生物学功能。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等重要作用。激活的巨噬细胞除了可以直接杀伤病原微生物，清除凋亡细胞和突变细胞外，其分泌的肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、粒—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、一氧化氮(NO)等免疫活性分子在先天性免疫防御和获得性免疫应答中更是起着不可忽视的作用。本课题主要研究枸杞多糖激活巨噬细胞的分子机制，具体分为两个部分，第一部分以宁夏中宁枸杞为原料，采用热水浸提法制得枸杞浸提液，运用超滤法分级分离枸杞多糖，得到不同分子量范围的三个多糖级分，硫酸苯酚法测定糖含量后，以RAW264.7细胞NO，TNF-a及GM-CSF的释放量为指标，观察三个级分对巨噬细胞的活化作用。实验结果表明：100g枸杞经脱脂，热水浸提，脱色，除蛋白，超滤得分子量范围5KD-30KD、30KD-50KD、大于50KD三个级分枸杞多糖，质量分别为2.6g、2.0g、3.2g，硫酸苯酚法测定糖含量分别为74.3％，69.8％，78.4％。Griess法测NO产量及ELISA法测细胞因子结果显示：分子量5KD-30KD、30KD-50KD、大于50KD三个级分枸杞多糖均能不同程度地促进巨噬细胞分泌NO，后两者还能促进巨噬细胞分泌TNF-a及GM-CSF。本试验得出的结论：超滤法可以简单、快速、有效地对枸杞多糖进行分离，所得的5KD-30KD、30KD-50KD、大于50KD三个级分对RAW264.7细胞均有不同程度活化作用，其中以大于50KD级分作用最为显著。第二部分以小鼠单核／巨噬类细胞RAW264.7为研究对象，观察从美国泛华公司购买的枸杞多糖作用于巨噬细胞对其释放细胞因子NO以及iNOS活性水平的影响，并初步探讨了Toll样受体4(TLR4)／核转录因子-kappa B(NF-κB)信号通路在这过程中的作用，旨在部分解释枸杞多糖对免疫系统调节作用的机制，为其在医学上的应用提供理论依据。实验中采用Griess还原法研究枸杞多糖对巨噬细胞释放NO的作用以及NF-κB抑制剂和TLR4抗体对枸杞多糖诱导巨噬细胞释放NO作用的影响，用诱导型一氧化氮合酶(iNOS)检测试剂盒测定胞质内iNOS的活性，Western blot法检测细胞核内NF-κB的变化。通过实验发现用200μg／ml剂量的枸杞多糖作用于RAW264.7细胞6h即可明显诱导NO的生成，6～18h之间NO释放的速度迅速增加，24h后NO的释放开始减少。实验中以单纯用全细胞培养液孵育的巨噬细胞作为阴性对照，以10μg／ml的脂多糖予以刺激的细胞作为阳性对照组。以10、50、200、500μg／ml剂量的枸杞多糖分别作用于RAW264.7细胞18h，可以观察到与对照组相比，10μg／ml枸杞多糖即能明显诱导巨噬细胞NO的产生，且随着剂量的增加，NO的产量不断增加，iNOS的活性不断增强。用TLR4抗体预孵育RAW264.7细胞1h，更换培养液后再加200μg／ml枸杞多糖予以刺激18h，发现TLR4抗体能抑制枸杞多糖诱导的RAW264.7细胞NO的产生。Western blot结果显示200μg／ml枸杞多糖作用于RAW264.7细胞6h，胞核内p65的含量明显增加，8h时达到高峰，10h活化程度开始减弱。另外，NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)作用于RAW264.7细胞90min，然后加入200μg／ml剂量的枸杞多糖对巨噬细胞进行刺激，发现PDTC在各个时间点(6、12、18、24h)都明显抑制枸杞多糖对巨噬细胞释放NO的诱导作用。实验结果还显示LPS的特殊抑制剂多粘菌素B(PMB)与枸杞多糖联合作用，不影响枸杞多糖对巨噬细胞的激活作用(P＞0.05)，表明可以排除枸杞多糖受LPS污染的可能。由以上实验得出的结论：枸杞多糖作用于巨噬细胞可明显诱导iNOS基因的表达，使NO生成增加，NF-κB信号传导途径参与枸杞多糖对巨噬细胞的激活过程，是枸杞多糖在体外激活巨噬细胞的重要途径之一，枸杞多糖可能通过Toll样受体4激活巨噬细胞。