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目的:克隆SD大鼠脑源性神经营养因子基因(BDNF)并构建含BDNF基因片段的逆转录病毒表达载体pLXSN-BDNF，在PA317细胞中包装，筛选出稳定的产毒细胞系，为BDNF基因导入神经干细胞治疗视神经损伤奠定实验基础；将经GFP标记的雪旺氏细胞移植到SD大鼠视网膜下腔，观察移植后的细胞生长和迁移情况，为视神经和视网膜细胞损伤后的再生修复和视功能的重建、为青光眼等视网膜视神经病变的治疗探索新的途径。
方法:提取SD大鼠海马组织的总RNA，RT-PCR扩增得到BDNF基因，克隆到T载体得到pMD-BDNF阳性质粒，利用EcoR I和Xho I位点将BDNF基因亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN中，PCR、酶切和测序都正确的阳性质粒命名为pLXSN-BDNF。将纯化后的pLXSN和pLXSN-BDNF质粒转染PA317包装细胞，用适当浓度的G418进行筛选。通过PCR和RT-PCR的方法分别对产毒细胞株和病毒上清液进行鉴定。超速离心法100倍浓缩病毒，荧光定量RT-PCR法和克隆形成法测定病毒滴度。将能高效表达GFP基因的载体pEGFP-N1转染雪旺氏细胞，24 h后将带荧光的雪旺氏细胞移植到SD大鼠视网膜下腔。用HRA、OCT、冰冻切片分别观察移植后不同时间点，雪旺氏细胞在局部的生长和迁移情况。
结果:成功扩增出BDNF基因，克隆到pMD18-T Simple载体，获得阳性克隆pMD-BDNF，测序结果与参考序列的核苷酸同源性为100％。利用EcoR I和Xho I位点将BDNF基因亚克隆入逆转录病毒载体pLXSN中，PCR、酶切和测序鉴定结果表明，所克隆的BDNF基因已经正确插入到逆转录病毒载体pLXSN中，得到阳性重组质粒pLXSN-BDNF。通过包装细胞PA317对病毒的包装和G418的抗性筛选后，PCR和RT-PCR鉴定结果表明，细胞基因组中已整合入BDNF基因，包装细胞PA317可以成功分泌含有BDNF基因的重组逆转录病毒。重组病毒pLXSN-BDNF 100倍浓缩，经荧光定量RT-PCR法和克隆形成法测定的滴度分别为6.92×10<6>copies/ml和3.2×10<5>CFu/ml。另外将EGFP转染的雪旺氏细胞移植到视网膜下腔后，经HRA、OCt和冰冻切片观察，移植后1 d，移植区局部可隐约见到移植的细胞团；移植后3 d，移植的细胞团块的面积增大；移植后2 w，团块逐步呈现单个细胞形态；移植后4 w，发光团块不仅在移植区局部出现，而且在离移植区稍远处也可见到。我们推测，该现象可能是移植的雪旺氏细胞在体内存活良好，并进行了近距离的迁移造成的。移植后6 w依然能看到移植的细胞团块，不过数量有所减少。
结论:本实验成功克隆了SD大鼠的BDNF基因，并构建了重组质粒pLXSN-BDNF，通过对病毒的包装，获得了稳定的产毒细胞株。建立了重组逆转录病毒滴度荧光定量RT-PCR检测方法，并与传统的克隆形成法进行了对比，结果表明所建立的荧光定量RT-PCR法在逆转录病毒滴度测定中具有很高的实用价值。移植的雪旺氏细胞在局部短时间生长良好，并有近距离迁移现象。pLXSN-BDNF病毒的获得和雪旺氏细胞移植的成功为今后探索以神经干细胞作为基因工程细胞，促进神经元再生和修复，为神经损伤性疾病开展基因治疗的可行性研究奠定了实验基础。