结直肠癌是最常见肿瘤，整个病程中一半的患者为晚期结直肠癌(AdvancedColorectal Cancer，ACRC)。化疗是ACRC治疗的主要手段，化疗药物5-FU与奥沙利铂或伊利替康的联合应用将ACRC中位生存期提高至20月，但化疗药物受其毒副作用的限制难以进一步提高疗效，近几年靶向药物西妥昔单抗联合化疗将ACRC中位生存期提高到24个月左右，成为目前临床及基础研究的焦点。西妥昔单抗联合化疗的疗效和安全性的数据主要来源于西方，国内缺乏大宗病例报道，本课题探讨了该方案在102例中国晚期结直肠癌的疗效和安全性及KRAS状态与疗效的关系。虽然西妥昔单抗在临床应用比较广泛，Kras基因为野生型是应用西妥昔单抗的首要条件，但其中至少还有近一半的患者未能获益，所以探讨西妥昔单抗的作用机制并进一步提高疗效是非常有意义的。目前关于西妥昔单抗的研究集中在西妥昔单抗作用靶点表皮生长因子(Epidermal Growth FactorReceptor，EGFR)的酪氨酸激酶途径，其实EGFR作用还存在非酪氨酸激酶通路，此途径的干预可能会提高西妥昔单抗抗肿瘤效应。最新研究证明EGFR与主动性Na+/葡萄糖共转运蛋白-1(Sodium Glucose Cotransporter，SGLT1)共表达，EGFRsiRNA下调SGLT1降低细胞内葡萄糖浓度而诱发自噬。自噬是在饥饿、缺氧情况下，细胞降解自身的蛋白质及细胞器，循环利用降解产生的物质以维持细胞的生存，过度自噬导致细胞自噬性死亡。自噬与肿瘤的关系存在争议：在肿瘤发展中是抑制还是促进作用；在肿瘤治疗中与化疗起协同作用还是化疗耐药机制。西妥昔单抗为EGFR的阻断剂，理论上可以同时作用于酪氨酸激酶及非酪氨酸激酶两个途径达到最大限度的抗肿瘤作用，但自噬是否为西妥昔单抗抗肿瘤作用的机制之一至今尚未见报道。本课题首先分析西妥昔单抗联合化疗治疗晚期结直肠癌的疗效；其次对结直肠癌组织进行EGFR、SGLT1及自噬相关分子Becl in-1、白噬发生的分子标志物微管相关蛋白轻链(microtubules associated protein light chain3，MAP1-LC3，简称LC3)进行检测，分析各分子与结直肠癌临床病理特征的相关性以及各指标与自噬的相关性，自噬相关蛋白表达对西妥昔单抗联合化疗治疗晚期结肠癌疗效的影响；再次，从细胞水平探讨西妥昔单抗作用于KRAS野生型且有EGFR表达的结肠癌细胞后SGLT1及Beclin-1、LC3的变化，西妥昔单抗是否诱导自噬及是否通过下调SGLT1诱导自噬，自噬在西妥昔单抗杀伤肿瘤细胞中的作用，自噬是否为西妥昔单抗增强伊利替康杀伤结直肠癌细胞的作用机制。　　 第一章102例晚期结直肠癌西妥昔单抗联合化疗的疗效分析　　 目的：　　 分析中山大学肿瘤防治中心102例接受西妥昔单抗联合化疗ACRC患者的资料，希望基于此相对大样本分析西妥昔单抗治疗中国结直肠癌患者的疗效和安全性；对具有病理标本的45例结直肠癌患者的KRAS进行检测，分析中国人结直肠癌KRAS状态对西妥昔单抗联合化疗疗效的影响。　　 材料和方法：　　 2005年1月至2008年12月中山大学肿瘤防治中心接受西妥昔单抗治疗的结直肠癌患者102例，病例的基本临床病理特征及治疗情况有详细记录，随访资料完整，本组病历末次随访时间是2010年3月22日，中位随访时间36.0个月。102例ACRC的患者收集到45例石蜡标本。采用PCR-DNA酶切法及定量法两种方法进行检测KRAS第2外显子的12、13密码子突变情况。统计采用SPSSl7.0软件进行分析。　　 结论：　　 1.ACRC西妥昔单抗联合化疗的ORR为43.1％，DCR为74.5％，中位PFS为4个月。西妥昔单抗联合化疗一线应用于ACRC的中位PFS较非一线者长(分别是5.5个月和3.0个月)，但西妥昔单抗联合奥沙利铂或伊利替康在ACRC中的疗效无差异。　　 2.结直肠癌患者初诊时有肿瘤相关症状或病理分级、临床分期高者预后差；西妥昔单抗联合化疗疾病得到控制者预后好。但临床分期及病理分级对西妥昔单抗联合化疗的近期疗效无影响。　　 3.结直肠癌KRAS突变率为28.2％，KRAS野生型结直肠癌西妥昔单抗联合化疗的ORR、DCR、PFS均优于KRAS突变型者。　　 第二章结直肠癌中EGFR、SGLT1、Beclin-1、LC3的表达与临床意义　　 目的：　　 检测结直肠癌组织中西妥昔单抗作用靶点EGFR、EGFR共表达蛋白SGLT1及自噬相关分子Beclin-1、自噬发生的分子标志物LC3的蛋白表达情况，了解四种蛋白表达的相关性，比较结直肠癌组织与正常肠组织上述蛋自表达的差异。分析EGFR、SGLT1、Becl in-1、LC3与结直肠癌临床病理特征的相关性，与西妥昔单抗联合化疗疗效的关系。　　 材料和方法：　　 102例接受西妥昔单抗治疗的结直肠癌中从我院病理标本库中找出45例石蜡组织；随机抽取在我院同期未采用西妥昔单抗治疗的病例65例，找到石蜡标本40例；收集到28例结直肠癌阴性切缘石蜡组织作为正常结直肠组织。SPA免疫组化方法检测85例结直肠癌及28例癌手术阴性切缘石蜡组织中EGFR、SGLT1、Beclin-1、LC3等蛋白质表达情况。采用SPSS17.0软件进行统计分析。　　 结论：　　 1.EGFR、SGLT1、LC3在结直肠癌组织中的表达水平均明显高于正常组织。并且EGFR、SGLT1、Beclin-1的表达与结直肠癌的自噬相关，西妥昔单抗可能通过EGFR影响自噬。　　 2.结直肠癌EGFR、SGLT1表达与临床分期之间具有明显相关性；EGFR表达越高，结直肠癌预后越差；LC3低表达者，西妥昔单抗联合化疗的ORR高，EGFR低表达者DCR高，Becl in-1低表达者PFS长，均提示自噬可影响西妥昔单抗的疗效。　　 3.EGFR表达与KRAS状态相关，KRAS野生型者EGFR表达高。　　 第三章西妥昔单抗F调SGLT1诱导自噬增敏伊立替康抗瘤的研究　　 目的：　　 阐明西妥昔单抗通过EGFR下调SGLT1诱导结肠癌细胞自噬的过程，探讨自噬在西妥昔单抗单药及联合伊立替康抗抗肿瘤机制中的作用，西妥昔单抗增敏伊利替康的机制是否与自噬有关。为进一步研究如何增加西妥昔单抗的疗效提供理论依据和实验指导。　　 材料和方法：　　 以人结肠癌细胞株HT-29(KRAS野生型)为研究对象，首先，研究西妥昔单抗作用于HT-29结肠癌细胞株后Beclin-1、LC3蛋白表达变化，明确是否诱导自噬发生，并找出诱导自噬发生的最佳药物浓度、作用时间。其次，研究西妥昔单抗作用于HT-29结肠癌细胞株后EGFR、SGLT1的蛋白变化，明确EGFR与SGLT1是否共表达和相互作用，西妥昔单抗是否可通过降低细胞表面的EGFR而下调SGLT1，最终诱发细胞由于葡萄糖匮乏、饥饿而发生自噬。最后，用自噬的特异性的阻断剂Beclin-1 siRNA瞬时转染HT-29结肠癌细胞株，阻断细胞的自噬，流式细胞术检测阻断细胞自噬前后西妥昔单抗和SN-38单药(伊利替康代谢的活性产物)以及两者联合用药引起细胞凋亡和坏死的变化。　　 结论：　　 1.西妥昔单抗可诱发结肠癌细胞株HT-29的自噬，可能通过下调SGLT1引起。　　 2.西妥昔单抗通过自噬逆转SN-38(伊立替康代谢的活性产物)的耐药，自噬是西妥昔单抗增敏SN-38抗瘤的机制之一。