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WT1基因编码一个含有四个锌指结构的转录因子,在多种动物组织和器官中表达并起到至关重要的作用,它不仅能调控肿瘤发生,也能调控组织或器官的生长发育。WT1存在WT1(+KTS)和WT1(-KTS)两种可变剪切体,在不同细胞或不同发育阶段能执行不同的生理功能。孕酮(P4)由颗粒细胞合成,参与卵巢发育的多种生理过程,对维持雌性动物正常的繁殖具有重要的作用,但WT1(+/-KTS)对鸡颗粒细胞孕酮合成的调控作用尚不十分清楚。本研究旨在研究WT1(+/-KTS)对鸡排卵前颗粒细胞孕酮合成的影响。利用实时荧光定量技术(RT-q PCR)检测了WT1在不同发育阶段的卵泡颗粒细胞中的m RNA表达,分析其表达趋势;在排卵前颗粒细胞中过表达WT1(+/-KTS),随后用适宜浓度的人重组卵泡雌激素(FSH)处理,收集细胞上清并通过放射免疫分析法(RIA)检测P4的浓度,用RT-q PCR检测不同处理组FSHR、STAR、HSD3B1和CYP11A1的m RNA表达,用蛋白质免疫印迹法(WB)分析细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)、RAF激酶蛋白(BRAF)和环磷酸腺苷效应元件结合蛋白(CREB)的表达活性。主要研究内容及结果如下:(1)WT1 m RNA在等级前颗粒细胞中的表达极显著高于排卵前颗粒细胞(P<0.01),并且维持在较高水平。在等级前颗粒细胞中WT1 m RNA表达呈先升再降的趋势,在大白卵泡(LWF,Large White Follicle)颗粒细胞内的表达量最多;(2)分别用0,30,50,100,150 ng/m L的人重组卵泡刺激素(FSH)处理离体培养的排卵前颗粒细胞,50 ng/m L处理组的细胞上清中孕酮浓度最大,后续实验采用50 ng/m L FSH处理细胞;(3)分别用pc-DNA3.1、WT1(+KTS)和WT1(-KTS)过表达载体处理离体培养的排卵前颗粒细胞,再用50 ng/m L FSH处理颗粒细胞;RT-q PCR和WB检测发现WT1过表达效率高,WT1(+KTS)和WT1(-KTS)均会显著抑制FSH诱导的孕酮合成(P<0.05);(4)当不用FSH处理时,WT1(+KTS)会显著抑制STAR、HSD3B1和CYP11A1 m RNA表达(P<0.05),但对FSHR没有显著影响(P>0.05);WT1(-KTS)会显著抑制CYP11A1m RNA表达(P<0.05),但对STAR、HSD3B1没有显著影响(P>0.05)。当用FSH处理时,WT1(+KTS)能显著下调FSHR、STAR和CYP11A1的m RNA表达(P<0.05),显著上调HSD3B1的m RNA表达(P<0.05);WT1(-KTS)能显著下调FSHR和CYP11A1的m RNA表达(P<0.05),但对STAR和HSD3B1没有显著影响(P>0.05);(5)WT1(+/-KTS)会抑制ERK1/2蛋白的磷酸化,但不会显著改变ERK1/2总蛋白和m RNA的表达;WT1(+/-KTS)显著降低BRAF蛋白磷酸化水平;(6)WT1(+/-KTS)显著抑制CREB总蛋白的表达,CREB的磷酸化水平也随之降低。综上所述,在排卵前颗粒细胞内,WT1(+/-KTS)能抑制ERK1/2信号通路从而降低了CREB蛋白的活性,进一步改变了FSHR和类固醇合成基因的m RNA表达,最终抑制颗粒细胞孕酮合成。