癌症已经成为当今世界上的一个严重的社会问题,每年因为癌症而死亡的人数正在急速增加,攻克癌症已经成为科研上和医学上的一个亟待解决的难题。在所有的癌症类型中,肺癌因为其高致病性和高死亡率而广受人们关注,肺癌是目前世界上致死人数最多的癌症类型,解决肺癌问题也是科研上一大难题。在大多数肿瘤细胞中,DR4/DR5等能够诱导细胞凋亡的受体都是高表达的,这自然提示科研人员,通过给与TRAIL等死亡配体,便能诱发肿瘤细胞的凋亡,进而消除肿瘤。但是,在临床实验中,科研人员发现,肿瘤细胞对于TRAIL诱导的细胞凋亡具有很强的抑制作用,而且,当TRAIL无法诱导肿瘤细胞凋亡时,却能促进肿瘤细胞的增殖,这让TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的治疗方案受到限制。经研究发现,在TRAIL诱导的凋亡通路中,存在一些抗凋亡的蛋白,这些蛋白包括DcR1、DcR2、CFLARL、CFLARs、XIAP等,这些蛋白的存在抑制了TRAIL诱导细胞凋亡的作用,那么,通过靶向这些抗凋亡蛋白,使肿瘤细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡敏感便成为我们解决TRAIL治疗肿瘤的一个思路。GMEB1是一个在各个组织中广泛表达的蛋白,它最初被鉴定为一个转录因子,在细胞核内,GMEB1能够和GMEB2相互作用,它们一起结合在酪氨酸氨基转移酶(TAT)基因启动子区的GME顺式元件上。在酪氨酸氨基转移酶基因启动子区的下游同样有一个转录因子结合区域GRE,在这个位置,糖皮质激素受体(GR)能够结合到这里从而对TAT的表达起到了促进作用。而GMEB1与GMEB2共同结合到GME上之后,能够抑制GR结合到GRE上,从而抑制了GR调控的TAT的基因转录。因此,GMEB1在细胞核内能够起到转录抑制作用。除此之外,还有研究表明,GMEB1在细胞核内能够与转录因子FOXL2结合,并对细胞凋亡起到一定的作用,但其具体机制并不清楚。除了在细胞核内作为转录因子发挥作用之外,GMEB1还被发现可以定位于细胞质内。GMEB1能够在细胞质内与pro-caspases结合,并抑制pro-caspases的活化与切割,进而抑制细胞凋亡,但是GMEB1抑制pro-caspases活化的具体分子机制还不清楚。GMEB1与pro-caspases的结合是通过GMEB1的羧基端结构域和pro-caspases的两个DED结构域的结合来实现的,由此我们也可推断,同样包含两个DED结构域,在蛋白结构上与pro-caspase 8具有非常相似结构的CFLARL可能同样与GMEB1存在相互作用。而CFLARL可以和pro-caspase 8结合并抑制pro-caspase 8的活化与切割,因此,我们推断GMEB1可能通过与CFLARL的结合抑制了 pro-caspase 8的活化与切割,进而抑制了细胞凋亡。综上所述,本文的研究目的主要为两个:一是研究GMEB1通过CFLARLL抑制pro-caspase 8活化的分子机制,二是研究GMEB1是否影响TRAIL诱导的细胞凋亡通路,即我们是否能通过对GMEB1的干预使肿瘤细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡敏感。我们首先对GMEB1和CFLARL的关系进行了分析,通过western blot检测它们在非小细胞肺癌细胞系中的蛋白表达水平,我们发现GMEB1和CFLARL的蛋白水平呈现正相关性;小分子药物SAHA能够同时以剂量依赖和时间依赖的方式降低GMEB1和CFLARL的蛋白水平。进一步分析显示,GMEB1并不在转录水平调控CFLARL,但是GMEB1促进了 CFLARL的蛋白稳定性。Western blot结果还显示,GMEB1过表达能够上调CFLARLL的蛋白水平,敲低GMEB1则导致CFLARL蛋白水平下降,而且这种下降可以由GMEB1的回复过表达所拯救。另外,GMEB1对CFLARL的调控主要是通过影响其蛋白酶体降解途径来实现的,GMEB1过表达抑制了 CFLARL的泛素化。以上实验结果表明,GMEB1通过翻译后修饰调控了 CFLARL的蛋白水平。为了继续研究GMEB1对CFLARL的调控机制,我们通过免疫共沉淀、GST Pull-down以及免疫荧光等实验对GMEB1和CFLARL的相互作用进行了检测,实验结果显示,在NSCLCs中GMEB1和CFLARL之间存在相互作用,这种相互作用发生在细胞质内。GMEB1和CFLARL的相互作用是通过GMEB1蛋白中氨基端的结构域和CFLARLL蛋白中P20和P12结构域的结合来实现的。因为GMEB1不能直接影响CFLARL的蛋白水平变化,通过分析NSCLCs中不同去泛素化酶的蛋白表达水平,我们找到了 GMEB1调控CFLARL的一个关键功能分子USP40。在NSCLCs中,USP40的蛋白水平分别于GMEB1和CFLARL的蛋白水平都呈正相关性,USP40能够促进CFLARL的蛋白稳定性,同时,USP40调控了 CFLARL的蛋白水平,过表达USP40使CFLARL蛋白水平升高,而敲低USP40则使CFLARL的蛋白水平降低。USP40与CFLARL同样在NSCLCs的细胞质中存在相互作用,它们之间的结合也是通过CFLARL的P20和P12结构域来实现的。另外,USP40过表达能够对CFLARL进行去泛素化,而敲低USP40则使CFLARL的泛素化水平增强,过表达USP40能够特异性的去除CFLARL蛋白上K48连接的多聚泛素化。USP40去泛素化酶失活突变后仍然能够与CFLARL结合,但是却无法上调CFLARL的蛋白水平并对CFLARL进行去泛素化。以上实验表明,USP40是CFLARL的一个去泛素化酶,它能直接调控CFLARL。我们接下来对GMEB1、USP40和CFLARL三个蛋白的关系进行了检测,通过co-IP实验发现,GMEB1能够分别于CFLARL和USP40结合,而且,GMEB1能够作为一个支架蛋白,促进USP40和CFLARL之间的结合。另外,在NSCLCs中,当敲低了 GMEB1之后,过表达USP40能够微弱的上调CFLARL的蛋白水平,但是当敲低了 之后,过表达GMEB1却无法上调CFLARL的蛋白水平,说明GMEB1对CFLARL的调控是通过USP40来实现的。研究清楚了 GMEB1调控CFLARL的分子机制,接下来我们对于GMEB1在TRAIL诱导的细胞凋亡中的作用进行了检测。通过co-IP实验发现,GMEB1敲低降低了 CFLARL在TRAIL诱导的DISC复合体中的组成比例。同时,GMEB1敲低增强了 caspase-8的酶活性,促进了 CASP8、CASP3和PARP的蛋白切割,促进了 TRAIL诱导的细胞凋亡。另外,GMEB1敲低也能使A549细胞对SAHA处理敏感,能够增强SAHA诱导的caspase-8酶活性,促SAHA诱导的CASP8、CASP3和PARP的蛋白切割,促进了 SAHA诱导的细胞凋亡。我们的研究同样显示,CFLARL的过表达能够减缓GMEB1敲低对肿瘤细胞的影响,导致GMEB1敲低引发的caspase-8的酶活性降低,CASP8、CASP3和PARP的蛋白切割水平减弱以及细胞凋亡减弱。CFLARL对GMEB1敲低效应的影响在TRAIL和SAHA处理A549细胞时表现一致。以上实验结果说明,GMEB1对TRAIL或者SAHA诱导的细胞凋亡具有抑制作用,这可能是通过CFLARL蛋白的功能来实现的。我们现在已经知道,GMEB1通过USP40调控了 CFLARL.,进而调控了细胞凋亡,但是,GMEB1对于CASP8的抑制作用是怎样实现的我们仍旧不清楚。接下来,我们对GMEB1、CFLARL和CASP8之间的相互作用进行了探究,发现,CFLARL过表达能够促进GMEB1和CASP8之间的相互作用,而GMEB1过表达则不影响CASP8和CFLARL之间的相互作用,说明,CFLARL对于GMEB1和CASP8之间的相互作用是重要的,GMEB1可能是通过CFLARL和CASP8结合在一起的,这可能是我们对GMEB1抑制pro-caspase 8的活性是一个重要的解释,说明GMEB1确实是通过CFLARL的作用抑制了 pro-caspase 8的酶活性,进而抑制了细胞凋亡。最后,我们构建并筛选了 GMEB1稳定敲低的A549细胞系,通过裸鼠异种移植瘤实验发现,GMEB1敲低抑制了裸鼠异种移植瘤的生长,GMEB1可能通过其对细胞凋亡的抑制作用影响了移植瘤的生长。而从TCGA数据库中得到的数据显示,GMEB1和USP40高表达都与肺腺癌肿瘤病人的不良预后相关。总之,我们的实验结果显示,在NSCLCs中,GMEB1和USP40都能够与CFLARL在细胞质内存在相互作用。USP40是CFLARL的一个去泛素化酶,它能靶向去除CFLARL蛋白上K48连接的多聚泛素化,促进CFLARL的蛋白稳定性,正调控CFLARL的蛋白水平。GMEB1对于CFLARL也具有正向调控作用,GMEB1通过促进USP40和CFLARL的结合调控了 CFLARL的蛋白水平。GMEB1通过对CFLARL的调控抑制了 TRAIL和SAHA诱导的细胞凋亡。CFLARL促进了 GMEB1与CASP8的结合,而GMEB1对CFLARL和CASP8的结合没有影响,说明GMEB1可能通过CFLARL与CASP8结合,同时GMEB1对CASP8活性的抑制也是通过对CFLARL的调控来实现的。在裸鼠异种移植瘤模型中,敲低GMEB1抑制了移植瘤的生长。而从TCGA数据库中得到的数据显示,GMEB1和USP40高表达都与肺腺癌肿瘤病人的不良预后相关。我们的研究阐明了 GMEB1对pro-caspase 8的抑制作用是通过对CFLARL的调控来实现的,我们首次鉴定了去泛素化酶USP40的一个底物是CFLARL,我们的研究还发现,GMEB1敲低能够大大促进TRAIL诱导的细胞凋亡,同时靶向GMEB1和TRAIL联合处理或许能够成为治疗肿瘤的新策略。