大环内酯类药物F806抗肿瘤活性与其作用分子机制

来源 :汕头大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:poshashajia
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目前,食管癌的分子靶向治疗已进入I/II期临床试验阶段,所用药物主要包括受体激酶抑制剂和肿瘤血管生成抑制剂。然而,就目前的实验数据来看,多数药物对食管癌的疗效并不显著,且研究主要集中在西方国家常见的食管腺癌及胃食管交界癌,而中国等亚洲国家相对高发的食管鳞癌(ESCC)方面的分子靶向治疗药物研究尚十分缺乏,因此,探索和开发针对ESCC的分子靶向治疗药物迫在眉睫。F806是从国内土壤链霉菌FIM-04-806发酵液中提取得到的天然化合物。初步的实验数据表明,F806具有潜在的抗癌活性。然而,在ESCC中,其体内外抗癌活性、安全性以及分子作用机制等均不清楚。基于此,在本文中,我们利用ESCC等多种恶性肿瘤细胞系与非肿瘤细胞系,同时建立荷瘤鼠模型,综合评价了 F806的体内外抗 ESCC等的活性与安全性;在此基础上,再通过联合应用稳定同位素标记(SILAC)和蛋白质谱等多种实验技术手段,深入揭示了F806的分子作用机制及其潜在的作用靶点,为将其作为抗ESCC候选药物,开展后续的开发研究提供了充分的理论依据。  首先,在以ESCC为主的各种恶性肿瘤细胞系与非肿瘤细胞系中,应用MTT法初步筛选了F806对细胞分裂增殖的影响。实验结果显示,1) F806对ESCC细胞等13种癌细胞系的分裂增殖均有明显的抑制作用,72 h的IC50在0.83-16.43μM之间,表明拥有广谱抗癌活性;2) F806在抗癌活性剂量浓度下,对6种非肿瘤细胞系的抑制作用不明显。  其次,通过联合应用荷瘤鼠模型、病理学细胞形态观察与生化分析等实验技术手段,探讨了F806的体内抗肿瘤活性与毒性。实验结果表明,1)在ESCC荷瘤鼠模型中,F806在4 mg/kg和8 mg/kg的剂量浓度下,能够显著抑制癌细胞的成瘤能力,显示其拥有很强的体内抗肿瘤活性;2)在抑制荷瘤鼠成瘤的过程中,F806有效剂量浓度并未对荷瘤鼠的肝、肾、心和脑等器官组织呈现明显毒性作用。  再次,以两种食管癌细胞系为模型,运用透射电镜、DNA Ladder琼脂糖凝胶电泳、TUNEL与细胞周期分析、蛋白免疫印迹等实验技术手段,研究发现,在 ESCC细胞中,F806可通过活化Caspase-9/12介导的线粒体/内质网应激途径,触发癌细胞凋亡。在此基础上,进一步通过综合运用“失巢凋亡”分析、粘附实验、免疫荧光、免疫共沉淀和蛋白免疫印迹等实验技术手段,阐明了F806能够抑制ESCC细胞中整合素β1的活性,阻断整合素信号通路活化,抑制癌细胞中粘着斑的形成,影响癌细胞与 ECM之间的粘附,诱发癌细胞发生“失巢凋亡”,发挥抗癌活性。  再者,以ESCC细胞系EC109为模型,运用SILAC与蛋白质谱等实验技术,鉴定了F806抑制ESCC细胞生长的差异蛋白表达谱。实验结果显示,共有1931个蛋白分子被鉴定并定量,其中181个蛋白发生显著下调表达,119个蛋白发生显著上调表达;运用Gene Ontology(GO)在线软件对发生显著差异表达的蛋白进行注释分析,结果表明,F806作用的差异表达蛋白与细胞增殖等生物学过程密切相关;应用SubpathwayMiner软件对这些差异表达蛋白相关信号通路进行富集分析发现,在富集的37个信号通路与56个子通路中,发生下调表达的 GRB2可能是 F806发挥其抗癌作用的关键节点分子。接下来,通过qRT-PCR、蛋白免疫印迹与荷瘤鼠动物模型等实验技术手段,验证了 F806的确能够诱导GRB2表达下调。并且,以shRNA稳定敲降 GRB2的ESCC细胞建立荷瘤鼠模型,确认GRB2表达下调能够抑制ESCC细胞生长,进一步验证了F806通过抑制GRB2表达发挥抗癌作用这一实验事实。  最后,通过组织芯片、IHC染色和生存率分析等手段,阐明了GRB2在食管癌中的表达模式以及与患者生存率的关系,确认其可作为抗癌治疗的靶点。实验结果表明,1)与配对的相对正常的食管上皮相比,GRB2在172例ESCC组织的胞浆中呈显著过表达;2) GRB2过表达与ESCC患者的淋巴结转移呈显著正相关;3) GRB2过表达与ESCC患者生存时间缩短显著正相关,是判断食管癌患者不良预后的独立指标。  总结上述诸实验结果,我们得出如下科学结论:F806作用于ESCC细胞,不仅可以有效阻断整合素β1的活性,同时还可以导致 GRB2表达显著下调,进而抑制癌细胞粘附与生长,发挥其抗癌活性。
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