青蛤(Cyclina sinensis)是一种常见的海产经济软体动物,其肉质鲜美,营养丰富,并且适应性和抗病性较强,是我国重要的海产增养殖对象。但是,随着国内养殖规模的扩大和养殖密度不断提高,有关青蛤大规模病害死亡现象的报道日益增多。因此,对青蛤免疫机制与相关抗病因子的深入研究,不仅可以为水产养殖中的病害防治提供新的理论指导,促进水产养殖产业的健康发展,而且能够深入探索无脊椎动物的先天免疫机制,为贝类学基础理论提供重要的实验数据。组织蛋白酶L(Cathepsin L-transferases,CPLs)是木瓜蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白酶C1家族的主要成员,其广泛存在于各类生物的所有组织当中,但它们在各自的表达模式上有所差异。除了已知的蛋白降解功能外,还能水解某些前体蛋白(酶原和激素原)生成其活性形式,或激活其他蛋白水解酶系统而使其发挥作用,从而参与机体的多种免疫、生理活动。在医学领域的最新研究证明,组织蛋白酶L指标对多种疾病的诊断有指示作用。本研究利用构建的cDNA文库筛选得到青蛤CsCPL基因,探究了该基因的表达规律,利用基因工程的方法对该基因及其抑制剂进行了体外重组表达,并分析了其生物学活性、功能以及相互之间的作用关系,初步探讨了CsCPL在青蛤先天免疫应答过程中的潜在作用。文章的主要研究内容如下:1、利用构建的青蛤cDNA文库,筛选到了类似CPLs基因全长序列(命名为CsCPL)。所获得的青蛤CsCPL基因的cDNA序列全长1632bp,开放阅读框ORF长度为1050bp,编码349个氨基酸,理论分子量为38.84KDa。N端结构域比较保守,具有蛋白结合位点(G位点),C端结构域差异性相对较大,具有特异性底物结合位点(H位点),决定了组织蛋白酶L底物的特异性。酶活性催化域含有4个催化位点(Gln149,Cys155,His294和Asn316),两条组织蛋白酶L签名序列(E58X3RX3F/WX2NX3IX3N77 和 G90X1NX1FX1D96)。经过比对发现,papain家族基因序列具有高度的保守性,CsCPL与缢蛏Cathepsin家族cathepsin L3基因一致性达到68%。通过系统发生树的构建显示,青蛤CsCPL与软体动物的组织蛋白酶L基因进化距离较近,与昆虫、脊椎动物进化距离较远。综合以上,CsCPL可以归为L型组织蛋白酶。2、利用实时荧光定量RT-PCR方法,测定了 CsCPL基因在青蛤五个不同组织中的分布,并在鳗弧菌侵染下分析了 CsCPL在血淋巴中的时序性表达。结果显示:在青蛤在五个组织中普遍性表达,其中血淋巴中表达含量最高,显著高于其他组织(P<0.05),肝脏中含量最低。染后3h表达量显著升高(P<0.05);并在6h表达量达到最大值,且与对照组差异极显著(P<0.01),约为对照组的2.7倍左右;24h后其表达量有所下降,但仍显著高于对照组(P<0.01);48-96h基因表达量逐渐降低并恢复至正常水平,可见鳗弧菌侵染对CsCPL基因的表达具有强烈的诱导作用。感染初期,青蛤受到该病原物侵袭时,相关免疫因子的基因启动,机体合成大量抗菌物质;当病原物被抑制后,相关物质在负反馈机制下合成速度减缓,因此青蛤CsCPL基因表达量呈现出先上升后下降的趋势。3、利用基因工程的方法对CsCPL基因进行体外原核表达。首先构建了CsCPL基因开放阅读框的重组表达质粒pET30a(+)-CPL,将构建好的重组质粒转化到表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS菌株中,在37℃条件下,利用终浓度1mmol/LIPTG进行大量诱导表达,结果表明诱导1h后出现了目的蛋白,分子量约为35KD,接近理论预期值。3h后表达量稳定,浓度不再增加。利用亲和层析方法,将表达的蛋白进行分离和纯化,透析法对得到的蛋白进行复性。4、对纯化出的青蛤组织蛋白酶L进行了抑菌实验分析,探究了重组蛋白的体外抑菌活性和体内免疫调节功能,并分析了温度和pH对蛋白活力的影响。结果表明,重组后的融合蛋白具有明显的抑菌活性,其最适温度约为30℃,最适pH约为5.0。该重组蛋白的体外抑菌活性明显低于其体内抑菌活性,将重组蛋白与鳗弧菌混合孵育后注射到青蛤体能,与单纯注射鳗弧菌相比,实验组青蛤表现出更强的微生物清除效率,可见其在免疫反应过程中的主要作用并非直接抑制菌体增长,而是间接增强青蛤免疫预防能力,推测其在青蛤体内发挥了免疫调节的作用。本研究通过对CsCPL的体外原核表达及分离纯化与活性分析,表明CsCPL在体外具有一定的抑菌活性,且在体内能够通过间接途径增强青蛤的抗病能力,在青蛤抵御病原微生物的胁迫中发挥了重要作用。这不仅有利于弥补贝类CPLs及其抑制剂的生理功能方面的理论不足,也为今后进一步阐明青蛤中存在的免疫识别路径、免疫防御调节过程提供了重要的实验数据。