水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)分别引起水稻白叶枯病(Bacterial leaf blight,BLB)和水稻细菌性条斑病(Bacterial leaf streak,BLS)。三型分泌系统(Type Ⅲsecretion system,T3SS)效应物(Effector)是水稻黄单胞菌最重要的致病因子,是细菌和寄主互作中具有决定性作用,决定细菌能否从寄主中获取养分以及抵抗寄主的防卫反应,最终决定病害的产生。T3SS效应物分为TAL(Transcriptionactivator-likeeffectors)效应物和non-TAL 效应物(Non transcription activator-like effectors)两大类。前者进入寄主细胞核后结合在寄主基因的启动子上,激活寄主抗病基因或感病基因的表达,诱导抗病或促进病害的发生。在Xoo菌株中发现Tal效应蛋白激发的感病基因是一类编码蔗糖转运蛋白的SWEET基因的表达,推测Xoo通过提高寄主向细菌生长的的非原质体空间转运蔗糖是细菌获取养分进而扩展、产生病害的重要机制。因此蔗糖的获取和代谢对Xoo的致病性具有决定作用。蔗糖代谢基因簇同样存在于Xoc菌株中,那么蔗糖代谢基因是否对Xoc的致病性具有类似的作用还不清楚。non-TAL基因包括编码Xop蛋白(Xanthomonas outer protein)的xop基因和编码蛋白经T3SS途径分泌的除TAL效应子外的其他基因,如Xoc含有的avrRxo1。现阶段的研究和生物信息学分析表明,一些Xop蛋白可能具有酶类活性或参与调控寄主植物的防卫反应信号,其中一些xop基因的功能具有品种选择性,因此XOP蛋白在细菌-寄主的互作中也具有重要作用。本文比较研究了Xoc菌株RS105和Xoo菌株PX099A蔗糖代谢基因簇的功能和Xoc菌株特有的3个Xop基因对细菌致病性的影响。在菌株Xce ATCC3313研究中发现Sux(Sucrose utilization in Xanthomonas)与细菌毒力相关,该基因簇参与蔗糖的吸收和代谢。,Sux基因簇编码一个非磷酸转移酶PTS(Non-phosphotransferase)蔗糖途径,Sux基因簇包含有两个MFS(MajorFacilitator Super)转运子SuxA和,SuxC,一个分解代谢基因,SuxB以及一个调控基因SuxR,该基因簇使细菌适应特定条件下它们所处的营养环境。基因簇,Sux旁侧的PXO02417编码一个ThiJ/PfpI家族的蛋白,推测其参与维生素B1合成,与细菌的生长有关,是否与糖类物质的利用和细菌的致病性有关还不清楚。本研究中我们利用同源臂双交换的方法敲除RS105(Xoc)和PX099A(Xoo)中的Sux基因并进行基因回补,获得RS105ΔSuxR、RS105ΔSuxC、RS105ΔSuxB、RS105ΔSux cluster 以及PXOΔSuxC、PX0Δ02417、PXOΔSux cluster缺失菌株和C-RS105ΔSuxR回补菌株。检测野生型菌株在蔗糖、葡萄糖作为碳源条件下的生长速率表明,蔗糖和葡萄糖中细菌的生长快,表明细菌偏好蔗糖和葡萄糖。菌落形态测定表明,蔗糖对胞外多糖的产生更加有利。同时对野生型菌株在各种糖培养基中Sux基因的表达进行了研究,结果表明蔗糖诱导Sux基因的表达,而其他糖份抑制Sux基因的表达。单个基因SuxB和SuxC及整个Sux基因簇缺失使细菌RS105以及PX099在蔗糖培养基中的生长速率降低,而在葡萄糖中的生长速率与野生型菌株没有差异,因此Sux基因簇是蔗糖代谢特异基因簇,对细菌的生长具有重要作用,但该基因簇的缺失对细菌对葡萄糖的吸收和利用没有影响。在日本晴水稻上的致病力测定表明PX099的Sux基因簇中不同基因的缺失突变体致病力表现不同程度的下降,因此PX099蔗糖代谢与细菌的毒力相关。但RS105菌中Sux基因的缺失导致细菌毒力的明显增强,这说明Xoc细菌在植物中获取的主要养分可能并不是蔗糖,部分原因来自于水稻细条斑病和白叶枯病发生的组织特异性的差异。参与生长物质维生素B1合成的基因PXO02417缺失后与野生型菌株PX099A相比,PXOΔ02417突变菌株对日本晴水稻的致病力没有显著差异,这说明维生素B1对细菌的致病性没有明显影响。在烟草上的过敏反应测定表明,缺失Sux基因簇后诱导非寄主过敏反应的能力与野生型比较没有显著差异,因此Sux基因簇不影响T3SS途径的其他效应子的泌出。XopAF、XopAK、XopO 3个蛋白是Xoc菌株特有的,而Xoo菌株中没有,基因组数据中曾对XopAF、XopAK的编码区有不同的预测,序列分析和文献报道都未能找到3个蛋白功能的线索。为了研究基因的编码结构,我们利用RT-PCR对基因转录产物进行了扩增分析,发现基因在人工培养基和植物中的表达结构可能存在差异。在此基础上对推测的CDS构建了融合表达标签,为下一步通过western检测基因在不同条件下的表达产物准备了材料。3个基因分别敲除后,以及XopAF、XopAK双敲除后,比较细菌在水稻上的致病力和在烟草上过敏反应,发现单个基因敲除后毒力和过敏反应没有明显变化,当XopAF、XopAK同时缺失后,细菌的毒力降低,在烟草上的过敏反应时间提前。结果表明两个基因可能参与抑制寄主的防卫反应,它们的功能可能是冗余的。3个基因的诱导表达分析研究表明,丰富培养基NB和诱导培养基XOM3中三个基因的表达水平显著低于在接种水稻后的表达水平。我们推测3个基因受到水稻的特异性诱导,但在推测的5’ UTR区并没有发现植物诱导启动子PIP-box的存在。为进一步证实5’UTR区的功能,设计并构建了3个基因5’UTR与eGFP基因的融合表达载体,将用于转入突变体中,接种水稻后观测荧光是否被水稻特异诱导。