大丽轮枝菌(Verticillium dahliae,VD)的寄主范围极广,可以侵染600多种植物,其中主要农作物184种,全球每年因其造成的经济损失超过10亿美元。在棉花上引起的棉花黄萎病被称为棉花的“癌症”,是我国棉花生产上的第一大病害,严重影响我国棉花的产量。近年来的研究表明大丽轮枝菌胞外分泌蛋白是造成棉花黄萎、落叶和减产的主要因素之一,因此深入研究大丽轮枝菌的胞外分泌蛋白将为制定有效的防治棉花黄萎病提供理论依据。本实验室前期通过二代测序技术对分离自棉花的高、低两种致病类型的大丽轮枝菌开展了全基因组测序工作。通过比较基因组学分析得到了髙毒力大丽轮枝菌VDG1相对于低毒力菌株VDG2的11个特异大片段。利用Signal P 3.0、TMHMM 2.0、Wo LF PSORT、Phobius和Y-Loc等生物信息学方法对特异大片段上编码的蛋白进行了分泌特性预测,并从中克隆了这11个特异大片段上6个特异分泌蛋白的编码基因;并将这6个特异的分泌蛋白分别命名为HSSP1(HighVirulent Special Secreted Protein 1,HSSP1)、HSSP2、HSSP3、HSSP4、HSSP5和HSSP6。依据基因组测序信息,设计跨内含子引物,分别通过PCR对这6个基因在VDG1中的特异性进行了验证;通过Signal P 3.0预测了其信号肽的编码序列,并利用酵母信号肽跟踪系统对预测的信号肽序列进行了活性验证。结果表明这6个信号肽序列均具有分泌活性,即这6个蛋白均为有活性的分泌蛋白。在此基础上对VDG1在侵染感病寄主军棉1号后的不同的侵染时间点检测了这6个基因的表达情况,检测表明这6个基因均在侵染早期被诱导表达。然后我们利用蔗糖、半乳糖、木糖、木聚糖、淀粉、果胶和纤维素等七个不同的单一碳源的培养基分析了VDG1中这6个基因在不同碳源营养条件下的表达情况,推测这6个基因可能参与了病原菌的早期侵染过程。为了明确这6个特异基因与大丽轮枝菌致病力之间的关系,建立了大丽轮枝菌由PEG介导的原生质体转化体系,并通过该体系成功获得了除HSSP4以外其它5个HSSPs基因。对这5个突变株的生物量(菌丝和孢子产量)进行了测定,结果发现突变株与野生型相比均明显降低,但是突变株之间的生物量降低程度差异较大。对这5个突变株利用单一碳源培养基分析了突变体对测试碳源的利用情况,发现虽然突变体菌落形态上并未产生较大变化,但对碳源的利用上却产生一定的差别。进而利用定量蘸根接种方法对这5个突变株进行了致病力测定,与野生型高达65的病情指数相比突变体的致病能力均有所下降,最高为50.27±1.34,最低为38.39±2.30。综上所述,这6个蛋白均为有活性的分泌蛋白,除HSSP4以外的5个髙毒力大丽轮枝菌VDG1特异的分泌蛋白均在其致病过程中发挥了重要作用。