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大黄鱼（Larimichthys crocea）隶属于鲈形目（Perciformes）、石首鱼科（Sciaenidae）、黄鱼亚科（Larimichthysinae）、黄鱼属（Larimichthys）,是我国重要的海水经济鱼类。随着大黄鱼养殖业的快速发展,病源性疾病日益严重,造成了巨大的经济损失。其中,病毒性疾病是制约大黄鱼养殖业绿色发展的主要病害之一。因此,深入研究大黄鱼抗病毒免疫机制,将为其病毒病防治提供理论依据和新思路。干扰素（Interferon,IFN）是一类可以引起宿主建立抗病毒状态的细胞因子,是脊椎动物抵御病毒感染的第一道防线。本实验室前期研究发现大黄鱼具有 LcIFNc（group Ⅱ IFN）、LcIFNd（group Ⅰ IFN）和 LcIFNh（group Ⅰ IFN）3种Ⅰ型干扰素,均具有抗病毒功能,但其表达模式及调控机制不同。本文在此基础上系统研究了大黄鱼3种Ⅰ型干扰素的受体及其信号通路,对于认识鱼类抗病毒感染的免疫应答机制具有重要理论意义,也为大黄鱼病毒病防治提供了理论依据。本文通过基因组分析克隆并鉴定了大黄鱼细胞因子受体家族B（cytokine receptor family B,CRFB）的 5 个成员 CRFB1、CRFB2、CRFB3、CRFB4 和 CRFB5,这5个受体基因在脾脏、头肾、鳃及大黄鱼头肾细胞系（Large yellow croaker kidney cells,LYCK）中对聚肌胞苷酸（polyinosinic:polycytidylic acid,poly（I:C））刺激显示出差异的诱导表达模式。利用大黄鱼抗病毒效应基因MxA启动子双荧光素酶报告基因检测系统,从5个候选受体中筛选得到了 LcIFNc、LcIFNd和LcIFNh相对应的受体组合分别是CRFB2/CRFB5、CRFB1/CRFB5 和CRFB1/CRFB5。进一步采用免疫共沉淀实验验证了 LcIFNs与相应受体亚基之间的互作关系。结果显示,LcIFNc分别与受体CRFB2、CRFB5的胞外段存在相互作用,LcIFNh分别与CRFB1、CRFB5的胞外段存在相互作用,从而验证了 LcIFNc的受体为CRFB2/CRFB5,LcIFNh的受体是CRFB1/CRFB5。但免疫共沉淀实验仅确认了LcIFNd与CRFB5的胞外段存在相互作用,未能检测到LcIFNd与CRFB1的相互作用。继而利用微量热泳动技术分析了 LcIFNd和受体CRFB1、CRFB5之间的亲和力,结果证明LcIFNd与CRFB1、CRFB5之间存在较强的亲和力,验证了LcIFNd的受体是CRFB1/CRFB5。本文以重组大黄鱼干扰素蛋白（rLcIFNc、rLcIFNd、rLcIFNh）刺激大黄鱼头肾白细胞为模型,研究了大黄鱼3种Ⅰ型干扰素对JAK-STAT信号通路的诱导激活作用。结果发现rLcIFNc、rLcIFNd、rLcIFNh分别刺激头肾白细胞后JAK-STAT信号通路关键分子Jak1、IRF9、STAT1、STAT2的转录水平均显著上调,说明了LcIFNc、LcIFNd和LcIFNh均可上调JAK-STAT信号通路关键分子的转录水平。由于转录因子STAT的磷酸化是JAK-STAT信号通路激活的关键环节,利用抗人STAT1磷酸化抗体检测了 rLcIFNs刺激大黄鱼头肾白细胞后大黄鱼STAT1的磷酸化水平变化,同时利用抗人STAT2总蛋白抗体,结合Phos-tag SDS-PAGE技术分析了大黄鱼STAT2磷酸化水平变化,结果发现rLcIFNc、rLcIFNd及rLcIFNh均可上调大黄鱼STAT1和STAT2的磷酸化水平。此外,还检测了干扰素激活的JAK-STAT信号通路下游抗病毒效应基因MxA、PKR和viperin的表达水平,发现rLcIFNc、rLcIFNd及rLcIFNh均可显著上调头肾白细胞中MxA、PKR和viperin的表达水平。这些研究结果表明,大黄鱼I型干扰素LcIFNc、LcIFNd和LcIFNh可通过激活JAK-STAT信号通路诱导抗病毒效应基因的表达。利用制备的抗CRFB1、CRFB2和CRFB5胞外段多克隆抗体进行的受体阻断实验结果发现,利用抗CRFB2胞外段多克隆抗体和抗CRFB5胞外段多克隆抗体单独,或该两抗体同时处理细胞后均可阻断LcIFNc诱导的Jak1、IRF9、STAT1和STAT2的表达上调、STAT1和STAT2磷酸化激活,以及下游抗病毒效应基因MxA、PKR和viperin的表达上调;利用抗CRFB1和抗CRFB5胞外段多克隆抗体单独处理,或该两抗体同时处理细胞均可阻断LcIFNd诱导的信号分子Jak1、IRF9、STAT1和STAT2表达上调、STAT1和STAT2磷酸化激活,以及下游抗病毒基因MxA、PKR和viperin的表达上调;同样利用抗CRFB1胞外段多克隆抗体和抗CRFB5胞外段多克隆抗体单独或该两抗体同时处理细胞均可显著抑制LcIFNh对Jak1、IRF9、STAT1和STAT2转录表达的诱导作用、STAT1和STAT2磷酸化激活,以及下游抗病毒基因MxA、PKR和viperin的表达上调。这些结果表明大黄鱼3种Ⅰ型干扰素是通过与相应受体结合来激活JAK-STAT信号通路,进而发挥其抗病毒效应。综上,本文鉴定了大黄鱼3种Ⅰ型干扰素的受体,系统地阐明了大黄鱼3种Ⅰ型干扰素通过与相应受体结合激活JAK-STAT信号通路,诱导下游抗病毒效应基因的表达来发挥其抗病毒功能,对深入认识鱼类抗病毒免疫机制具有重要意义,也为今后利用干扰素防治鱼类病毒病提供了理论依据。