研究背景:美西螈具有再生受损组织的强大功能,这种惊人的再生能力数百年来一直吸引着科学家的关注,因此常常被用作模式生物来揭示再生的奥秘。既往研究,发现蝾螈的再生过程与炎症反应密切相关。巨噬细胞作为影响组织再生的关键免疫细胞,通过促进伤口清创和依次产生趋化因子、促炎和抗炎细胞因子来调节组织再生。巨噬细胞具有一定的表型可塑性,其对激活刺激的局部微环境信号做出反应后可极化成两种不同的功能状态。其中M1型巨噬细胞特征性表达CD86,分泌促炎细胞因子,执行促炎功能;M2型巨噬细胞特征性表达CD163,分泌抗炎细胞因子,发挥组织修复功能。然而,巨噬细胞不同表型在美西螈肢体再生中的作用机制尚不清楚,还需深入研究。方法:本研究首先建立了美西螈断肢再生模型,通过HE和Masson染色,分析再生过程中组织内部形态变化;再根据美西螈基因库设计相关引物,利用PCR技术扩增CD86、CD163基因开放阅读框序列,然后通过测序和构建系统发育进化树进行分析;利用q RT-PCR技术去检测CD86、CD163基因表达情况。通过分子克隆技术构建原核表达载体,IPTG诱导表达CD86、CD163重组蛋白,提纯后作为抗原免疫小鼠制备单克隆抗体,通过间接ELISA、细胞免疫荧光和Western blot去鉴定抗体特异性。将抗体经过饱和硫酸铵法进行纯化后,先在体外验证抗体通过补体激活的经典途径对巨噬细胞的溶解功能,再在美西螈截肢后,体内进行抗体注射实验,观察肢体再生情况,利用HE、Masson和q PCR技术进行分析。实验分为4组进行,分别是注射αCD86抗体组,注射αCD163抗体组,注射αCD86+163抗体组,PBS作为对照组,抗体注射剂量为125μg/100 g,每组注射6只。结果:观察到美西螈断肢再生过程,在1 dpa时伤口上皮形成,在7 dpa时芽基出现,直至42 dpa肢体再生完全。同时检测出美西螈的CD86、CD163基因在7 dpa时的转录水平最高;成功构建出p ET28a-sumo/CD86、p ET28a-sumo/CD163原核表达载体,诱导出CD86、CD163重组蛋白,并成功制备抗CD86、CD163单克隆抗体,且都与重组蛋白、内源性蛋白和腹腔巨噬细胞有很强的特异性结合。在体外验证出抗CD86和抗CD163单克隆抗体对巨噬细胞有很强的溶解功能;体内的注射实验发现,分别注射抗CD163或抗CD86+CD163抗体组的蝾螈肢体再生失败,注射抗CD86抗体的美西螈的肢体再生正常,且一定程度上促进了再生。在30 dpa、40 dpa对其表达水平进行分析,发现与PBS组相比,抗CD86抗体注射组中CD86表达水平在30 dpa时有所降低,且有统计学差异;抗CD163抗体注射组的CD163表达水平在30 dpa时降低,且有显著差异,在42 dpa时表达水平也降低,具有统计学差异。结论:本研究证实了M1型和M2型巨噬细胞在美西螈断肢再生过程中发挥着关键作用。在炎症条件下和肢体再生过程中研究M1和M2型巨噬细胞的调控作用,将有助于改善愈合并提出再生治疗策略。