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目的：构建 hTERT启动子介导的 E1A/IL-24共表达靶向腺病毒载体（pAd-hTERT-E1A-IL-24），研究其对肝癌的抑瘤效应，并从细胞凋亡和生长周期、血管形成、浸润等方面，探索其抗肿瘤作用的分子机制。 方法：按分子克隆原理，用套式PCR从MCF-7的DNA基因组中亚克隆出hTERT启动子(hTERTp)，将其插入pTrack质粒转移载体形成pTrack-hTERT。PCR扩增目的片段E1A、polyA-promoter和IL-24基因，依次亚克隆至pTrack-hTERT转移载体，构建 pTrack-hTERT-E1A-polyA-promoter-IL-24双基因共表达靶向转移载体。同理构建pTrack-CMV-E1A-polyA-promoter-IL-24双基因共表达转移载体。上述二个构建正确的转移载体及pTrack空载体经PmeI酶切后与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒在BJ5183大肠杆菌中同源重组，得到的同源重组质粒 pAd-hTERT-E1A-IL-24（靶向）、pAd-CMV-E1A-IL-24及pAd经PacI酶切、再用脂质体转染QBI-293A包装细胞，经多轮感染和扩增后获得高滴度的 Ad-hTERT-E1A-IL-24（简称 Ad-h-E1A-IL-24）、Ad-E1A-IL-24及Ad病毒子。将5、10、25、50及100 MOI的Ad分别感染SMMC-7721肝癌细胞，筛选出Ad的最佳感染剂量为25 MOI。将最佳感染剂量的Ad-h-E1A-IL-24和Ad-E1A-IL-24病毒子分别感染SMMC-7721肝癌细胞和HL7702人正常肝细胞，流式细胞仪鉴定两种病毒对该细胞的感染率，MTT鉴定其对正常细胞的毒性作用。 将体外培养的 SMMC-7721肝癌细胞分成 PBS、Ad、Ad-E1A-IL-24及Ad-h-E1A-IL-24组，分别加入最佳感染剂量的上述腺病毒。RT-PCR、间接免疫荧光法和Western Blot法检测外源性E1A和IL-24在SMMC-7721细胞中的转录与表达；MTT法检测体外抑制肝癌细胞及人正常肝细胞HL7702生长效应，Hoechst33258荧光染色及 FCM检测其诱导肝癌细胞凋亡效应，RT-PCR法检测凋亡、细胞周期调节及肿瘤浸润相关的细胞因子 Bax、Bcl-2、P21、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2基因的转录表达；并建立裸鼠SMMC-7721人肝癌荷瘤模型，观察体内抑瘤作用。将成瘤后的裸鼠分为PBS、Ad、Ad-E1A-IL-24及Ad-h-E1A-IL-24组，每组5只。病毒干预后测肿瘤体积及瘤重。免疫组化法检测外源性E1A及IL24在荷瘤中的表达，检测细胞凋亡、肿瘤浸润及血管形成相关因子 Bax、Bcl-2、Fas、Caspase3、MMP2、MMP9、VEGF和CD34的表达。 结果：成功构建了hTERT启动子和CMV介导的E1A和IL-24共表达腺病毒载体，并得到表达高价Ad-h-E1A-IL-24和Ad-E1A-IL-24的腺病毒载体病毒子。25 MOI的最佳感染剂量的 Ad-h-E1A-IL24和 Ad-E1A-IL24两组病毒子对肝癌细胞的感染率分别65.53％和41.71%（P<0.01）。Ad-h-E1A-IL24病毒子对HL7702的毒性作用明显小于Ad-E1A-IL24。 RT-PCR检测到外源性E1A和IL-24在SMMC-7721细胞中的转录，间接免疫荧光法和Western Blot法均检测到外源性E1A和IL-24蛋白在SMMC-7721细胞中的表达。体外研究结果，MTT检测结果表明，Ad-h-E1A-IL-24抑制SMMC-7721肝癌细胞的生长明显优于Ad-E1A-IL-24组（P<0.05）；FCM检测结果显示，与Ad-E1A-IL-24组比较，Ad-h-E1A-IL-24诱导肝癌细胞的凋亡率明显升高（P<0.05）；RT-PCR结果显示，Ad-h-E1A-IL-24能明显上调SMMC-7721肝癌细胞中与细胞周期和凋亡相关的因子Bax和P21的表达，下调Bcl-2的表达也更为显著。体内模型抑瘤实验结果显示， Ad-h-E1A-IL-24明显抑制裸鼠 SMMC-7721人肝癌荷瘤的生长，明显高于Ad-E1A-IL-24组（P<0.05）。同时使肿瘤组织坏死明显增多，肿瘤间质内血管减少。免疫组化结果表明：Ad-h-E1A-IL-24与 Ad-E1A-IL-24组比较，前者可明显上调SMMC-7721肝癌荷瘤中的与凋亡相关的 Bax（P<0.01）、Fas（P<0.01）和 Caspase3（P<0.05）基因表达；下调与肿瘤凋亡与血管形成因子相关的Bcl-2（P<0.05）、VEGF（P<0.01）和 CD34（P<0.01）的表达，下调与肿瘤浸润及转移相关的因子 MMP2（P<0.05）的表达。 结论：1.国内外首次成功构建了hTERT启动子介导的E1A和IL-24共表达靶向腺病毒载体。2. Ad-h-E1A-IL-24地体内、外能明显抑制SMMC-7721细胞生长，其效果强于Ad-E1A-IL-24，且对正常细胞呈低毒性。3. E1A及IL-24基因对SMMC-7721细胞生长抑制作用可能是通过上调与凋亡及细胞周期相关基因Bax、Fas、Caspase3、P21、下调Bcl-2基因的表达；下调与肿瘤血管形成相关基因VEGF、CD34的表达；下调与肿瘤转移相关因子MMP2基因的表达有关。