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目的随着氟神经毒性分子机制研究的深入,过量氟暴露引起的神经系统结构和功能的损伤已成为研究热点。儿童期处于大脑快速发育阶段,对氟暴露更敏感,即使在较低浓度也能对大脑造成损害。已有研究发现过量氟暴露能导致儿童神经行为异常,出现注意力缺陷多动障碍、身心问题和学习记忆障碍等行为问题,但氟引起这些改变的具体机制尚未完全阐明。研究发现,CRTC1/BDNF/VGF信号通路与多种神经行为异常密切相关;然而,该通路是否氟暴露引起神经行为异常的关键通路?同时,作为CRTC1分子上游的SIK2,是否通过调控CRTC1/BDNF/VGF通路,进而在氟致神经行为改变中发挥作用,目前均不清楚。本研究旨在通过体内实验及体外实验,探讨SIK2调控CRTC1/BDNF/VGF通路在氟致子代大鼠神经行为异常中的作用,以期为氟的神经毒性机制的研究提供新的线索。材料与方法1.体内模型的构建及大鼠神经行为的测定选取健康成年SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠构建体内氟染毒模型,适应性喂养一周后随机分为4组,包括1个对照组和3个染毒组（10mg/L、50mg/L和100mg/L Na F）,分组当天开始染毒。染毒一周后进行合笼,雌鼠检查到阴道栓塞视为受孕成功,将临近生产的雌鼠单独饲养。子代鼠PND 21断乳时,每组随机选择出生日期及体重相近的15只子代雄鼠作为研究的实验鼠,并按照亲代的染毒浓度继续染毒,PND 90结束染毒。采用旷场实验、高架十字迷宫实验、强迫游泳实验和悬尾实验等检测染氟大鼠行为学改变。2.氟致大鼠脑组织的病理改变利用HE染色观察不同浓度氟暴露致大鼠海马和内侧前额叶皮质组织结构及细胞形态的病理改变。3.体外模型的构建及氟暴露剂量的筛选利用高分化的大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）建立氟染毒的体外模型,通过CCK8检测不同浓度Na F（0、10、20、40、80、100、120mg/L）染毒24h后的细胞活性,以确定后续染毒浓度。利用50μM的SIK2小干扰RNA（SIK2-si RNA）转染细胞12h后,Na F（80mg/L）再处理细胞24h;5μM的7,8-二羟基黄酮（7,8-Dihydroxyflavone,7,8-DHF）预先处理细胞6h后,Na F（80mg/L）再处理PC12细胞24h。4.氟暴露对SIK2-VGF通路相关基因表达的影响采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）和Western Blot分别检测大鼠海马、内侧前额叶皮质区及PC12细胞中SIK2、CRTC1、BDNF、VGF基因的m RNA和蛋白表达水平。通过免疫荧光检测CRTC1和BDNF蛋白在海马和内侧前额叶皮质组织的蛋白定位。5.氟暴露对细胞凋亡的影响采用Western Blot分别检测大鼠海马、内侧前额叶皮质区及PC12细胞中凋亡蛋白cleaved Caspase 3的蛋白表达水平。利用FITC/PI双染法结合流式细胞仪检测氟暴露对PC12细胞凋亡的影响。通过免疫荧光检测cleaved Caspase 3蛋白在海马和内侧前额叶皮质组织的蛋白定位。6.统计学分析使用Excel 2016软件进行数据记录,用Image J软件对蛋白条带灰度图进行量化分析,分别利用SPSS 21.0和Graph Pad Prism 6.0进行统计分析和绘制统计图。采用单因素方差分析进行多个组间连续性数据的比较,组间差异采用Dunnett t-test或Least-Significant Difference（LSD）检验进行分析,检验水准为α=0.05。结果1.氟暴露对大鼠神经行为的影响旷场实验中,50mg/L Na F和100mg/L Na F组大鼠的活动总路程低于对照组大鼠,各染氟组大鼠的中央路程和中央探索时间均显著低于对照组（P<0.05）;在高架十字迷宫实验中,各染氟组大鼠在开臂内运动的距离、在开臂停留时间、进入开臂次数均显著低于对照组（P<0.05）;强迫游泳实验中,与对照组相比,各染氟组大鼠的静止时间显著升高,游泳时间显著降低（P<0.05）;悬尾实验中,与对照组相比,各染氟组大鼠的静止时间显著升高,挣扎时间显著降低（P<0.05）。2.氟致大鼠脑组织病理学改变HE染色结果表明,对照组大鼠海马及内侧前额叶皮质区神经细胞结构完整且轮廓较清晰,随着氟暴露浓度的升高,可见神经细胞数量减少、稀疏,排列不规则、紊乱,间质水肿疏松程度增加。3.氟暴露对SIK2-VGF通路相关基因表达的影响在大鼠海马和内侧前额叶皮质区中,50、100mg/L染氟组的CRTC1、BDNF、VGF的m RNA和蛋白表达水平较对照组显著降低,SIK2的m RNA和蛋白水平较对照组显著升高（P<0.05）;在PC12细胞中,与对照组相比,40、80mg/L染氟组的SIK2的m RNA和蛋白水平显著升高;CRTC1、BDNF、VGF的m RNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）;预先SIK2-si RNA干预后,与单独Na F+空载体组相比,SIK2蛋白水平显著降低,CRTC1、BDNF、VGF蛋白水平显著升高（P<0.05）。预先7,8-DHF干预后,VGF的表达与单独染Na F组（80mg/L Na F）相比显著升高（P<0.05）。免疫荧光实验结果显示,大鼠海马及内侧前额叶皮质区细胞核外BDNF和核内CRTC1蛋白表达水平随着氟暴露的增加而逐渐下降,PC12细胞核内的CRTC1蛋白表达水平随着氟暴露的增加也逐渐下降。4.氟暴露对细胞凋亡的影响Western Blot结果表明,与对照组相比,随着染毒剂量的增加,大鼠海马、内侧前额叶皮质区和PC12细胞中的cleaved Caspase 3蛋白水平显著升高（P<0.05）。免疫荧光实验结果显示,大鼠海马及内侧前额叶皮质区细胞中cleaved Caspase 3蛋白水平随着氟暴露的增加也逐渐增加。预先SIK2-si RNA干预后,与单独Na F+空载体组相比,cleaved Caspase 3蛋白水平显著降低（P<0.05）。预先7,8-DHF干预后,cleaved Caspase 3的表达与单独染Na F组（80mg/L Na F）相比显著降低（P<0.05）。细胞凋亡结果表明,随着染毒剂量的增加,PC12细胞的凋亡率显著升高（P<0.05）。SIK2-si RNA或7,8-DHF干预后染氟组,与单独染氟组相比,细胞凋亡水平显著降低（P<0.05）。结论1.过量氟暴露可引起海马和内侧前额叶皮质组织病理改变,并导致大鼠神经行为异常。2.氟暴露通过改变SIK2表达,调控CRTC1/BDNF/VGF通路诱导细胞凋亡,从而在氟致大鼠神经行为异常中发挥重要作用。