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乙型肝炎病毒(HBV)感染是严重威胁人民生命健康的疾病。乙肝感染肝炎迁移不愈、并可能发展为肝细胞癌(HCC)的根源在于肝细胞核内cccDNA池的持续存在及HBV整合入宿主细胞。我们采用改进后的灵敏、特异、简便的SYBR Green I RT-PCI(?)法及高通量序列捕获测序技术分别对急性自限性乙肝患者(AHB)、抗病毒治疗不同预后慢性乙肝患者(CHB)的肝细胞cccDNA水平及HBV整合情况进行检测,确定可代表CHB治愈的肝细胞cccDNA阈值,了解乙肝患者HBV整合的一般情况。第一部分：cccDNA检测方法学的建立目的：建立灵敏、特异、简便的肝细胞HBV cccDNA检测方法。方法：从PSAD酶切、荧光采集温度、肝组织DNA提取等方面对传统cccDNA SYBR Green I RT-PCR检测法进行改进。结果：改进后的cccDNASYBR Green I RT-PCR检测方法简便,特异性好,灵敏度高,其检测下限值达24copies/μl。结论;简便、灵敏、特异的肝细胞cccDNA检测方法的建立为临床大量乙肝患者肝细胞cccDNA检测奠定了基础。第二部分：肝细胞内cccDNA水平对抗病毒治疗CHB患者预后的预测价值研究目的：探讨肝细胞内cccDNA水平对抗病毒治疗CHB患者预后的预测价值及与患者病毒学、血清学、病理指标的相关性。方法：对60名乙肝患者,包括11名AHB患者、46名接受抗病毒治疗CHB患者[21名原发性治疗失败、11名实现持续病毒学反应(VR)、15名实现持续VR和HBsAg血清学清除]及3名自身免疫性肝炎患者的肝细胞cccDNA和总DNA(tDNA)水平、血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg和ALT水平进行检测。结果：AHB患者肝细胞cccDNA和tDNA水平(分别为0.002copies/cell和0.04copies/cell)显著低于CHB患者。实现持续性VR和HBsAg血清学清除CHB患者的肝细胞cccDNA水平(0.012copies/cell)显著低于原发性治疗失败患者(4.18copies/cell, P﹤0.0001),但和实现持续性VR患者无显著差异(0.039copies/cell,阐.169)。实现持续性VR和HBsAg血清学清除CHB患者的肝细胞平均tDNA水平(0.096copies/cell)显著低于原发性治疗失败患者(371copies/cell, P﹤0.0001)及实现持续性VR患者(1.62copies/cell, P=0.001)。 ROC曲线分析显示肝细胞cccDNA水平(0.015copies/cell)和tDNA水平(0.23copies/cell)在预测实现持续性VR和HBsAg血清学清除方面没有显著差异(ROC曲线下面积分别为0.88和0.96,P>0.10)。肝细胞cccDNA水平和血清ALT、HBeAg及肝细胞tDNA水平显著正相关(P=0.024,P=0.001和P<0.0001),和血清HBV DNA无相关性(P=0.12),和血清HBeAg阴性及及HBeAg阳性患者血清HBsAg水平无相关性(P=0.84和P-0.146)。结论：AHB和抗病毒治疗后实现持续性VR和HBsAg血清学清除的CHB患者肝细胞内存有极微量的cccDNA。肝细胞cccDNA水平检测有希望成为预测抗病毒治疗预后的可靠指标。第三部分：高通量测序及Sanger测序检测乙肝患者HBV整合研究目的：探讨乙肝携带者、AHB及抗病毒治疗CHB患者的HBV整合情况。方法：采用高通量序列捕获测序技术检测2名乙肝携带者、3名AHB患者及13名抗病毒治疗后CHB患者HBV整合状况。对整合位点reads支持大于2个的14个整合位点用常规PCR和Sanger测序进行验证,并检测这14个整合位点在全部18名乙肝患者中的存在情况。结果：高通量测序结果显示18名乙肝患者中HBV整合阳性率为100%,患者整合位点总数为2083个,平均整合位点为138.2±379.9个/人,其中原发性失败患者HBV平均整合位点数目最多(248.5±57.3个/人),实现持续性VR患者次之(18.6±13.7个/人)。乙肝患者HBV整合位点数目与肝细胞cccDNA水平、平均覆盖度及肝细胞HBsAg积分显著正相关(均为P<0.0001)。Sanger测序法验证14个整合位点成功率为100%,18名乙肝患者均出现整合位点Chr16：51320015。结论：乙肝患者HBV整合阳性率为100%,其整合位点数目和患者检测平均覆盖度、肝细胞HBsAg积分显著正相关。整合位点Chr16：51320015为广泛发生的主要整合位点(MIS)。第四部分：HBV整合病毒-宿主基因嵌合体转录表达和整合位点Chr16：51320015定量检测研究目的：研究14个HBV整合位点的病毒-宿主基因嵌合体转录表达,并对整合位点Chr16：51320015进行定量检测。方法：采用反转录PCR法检测14个HBV整合位点的病毒-宿主基因嵌合体转录表达,采用分子克隆及荧光定量PCR法定量检测18例乙肝患者的整合位点Chr16:51320015拷贝数。结果：嵌合体转录表达研究显示1、3、4、5、6、12、14号整合位点出现病毒-宿主基因嵌合体转录表达,其中除4号HBV整合区域为S区外、6号为前C区外,其余均为X区。18例患者整合位点Chr16：51320015均值为1.46×10-2±4.94×10-2copies/cell,其中最大值为0.212copies/cell,最小值为3.48x1O-5copies/cell。结论：病毒-宿主基因转录表达与HBx基因整合密切相关,HBsAg可以由整合S区复制产生。18例Chr16：51320015整合位点均为高拷贝克隆扩增。