论文部分内容阅读
叶酸是人体正常发育的重要微营养物质（micronutrient），对于维持造血系统的正常功能、防范发育缺陷、预防心血管疾病都具有积极的作用。叶酸缺乏对遗传物质的影响至少有两个方面：（1）通过一系列代谢活动，合成S-腺苷甲硫氨酸，为DNA的甲基化提供甲基；（2）参与脱氧尿嘧啶核苷酸（dUMP）向脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）的转化。叶酸对于保证DNA的正常甲基化，维持正常的基因表达与DNA构型，保证某些着丝粒部位高度甲基化的染色体正常分离可能具有重要作用；此外缺乏叶酸可能导致dTMP合成受阻，dUMP积累掺入DNA，在继后的DNA复制和修复过程中因引起基因突变、原癌基因活化、DNA单双链断裂、染色体的断裂等遗传毒性效应。 本研究采用胞质阻滞微核分析（CBMN）进行叶酸缺乏对人类细胞产生的遗传毒性和细胞毒性的研究。胞质阻滞微核分析可以提供较为综合的细胞毒性和细胞遗传毒性信息。其中细胞毒性指标包括细胞的NDI、Apo频率和Nec频率，而遗传毒性指标主要包括经CB阻断胞质分裂后的双核细胞的MN频率、NPB频率以及BUD频率。 本研究分为两部分：第一部分为叶酸缺乏对乳腺癌患者淋巴细胞株细胞与遗传毒性的探讨，第二部分为叶酸缺乏对正常人外周血淋巴细胞的细胞与遗传毒性的探讨。 一、叶酸缺乏对乳腺癌患者淋巴细胞株细胞与遗传毒性的探讨 本部分研究叶酸缺乏对乳腺癌患者淋巴细胞株（GM13705，BRCA1突变）细胞活动及遗传物质的影响。正常人类淋巴细胞株（GM12705）为相应对照。培养基为含不同叶酸浓度的RPMI1640（6nM、12nM、60nM、120nM、240nM及2260nM，最高浓度为常规RPMI-1640培养基叶酸浓度），细胞于37℃、5％CO2云南师范大学硕卜研究生毕业论文进行9天的长周期培养，每3天换一次相应培养基，培养至第8天后，加入细胞松弛素（终4.5 pg/m1），继续培养28小时后I000rpm离心弃上清液，在沉淀的细胞中加入约20 pl含有5%DMSO的小牛血清，温和混匀，室温下静置smin，涂片，空气干燥，甲醇固定10min，5%Gi elnsa染液（PH7.O）染色smin，空气干燥，中性树脂封片。每一张片子分析500个细胞的坏死细胞数和凋亡细胞数以及1000个具有MN、NPB以及BUD的双核细胞，分析细胞Nec频率、AP。频率、NDI和双核细胞的M叫频率、NPB及BUD的频率。本部分研究结果指出:1.携带丑丑CA了突变基因的乳膝描患者琳巴细饱株（GM13705）: 细胞毒性分析:1)NDI在各组浓度没有显著性差异（P>0.05）。2) GM 1317仍的Apo频率与叶酸浓度之间表现出负相关（rAPoPTosls=一0.706），且在120一240nM之间Apo频率降到了最低。3)在叶酸缺乏（ 6nM、12nM）的条件卜，细胞NeC频率的平均值较大，与其他浓度的平均值相比表现出明显的差异（一，<0.05）。与叶酸浓度呈现出负相关（:NEeRosls=一0.472）。在240nM的时候，细胞Nec频率降到最低。 细胞遗传毒性:l)在叶酸浓度为6nM、1 ZnM、60nM时双核细胞的MN频率明显的高于其他叶酸浓度的（P<0.05），叶酸为120南的时候，降到了最低。2)在叶酸浓度较低的条件下双核细胞NPB频率均显著高于120翩、240nM及2饰O翩 （尸<0.05），在后三个浓度的NPB没有差异（P>0.05），也表明了NPB频率在120nM的时候降到了最低。3)随着叶酸浓度的升高BUD逐渐降低，且与叶酸呈现负相关（r=一0.515）。4)双核细胞的MN与NPB、BUD及NPB与BUD之间有着显著的正相关（r=0.764，P（0.001;r== 0.854，P（0.001;r拍.837，P（0.001沁同时双核细胞的MN，NPB，BUD频率与叶酸剂量呈现出负相关（ro.护一0.546;r、:行一0.537;r .oj=一0.515）。在叶酸浓度为120一240 nM时由叶酸缺乏引起的遗传损伤降到最小。GM 1 3705的遗传稳定性在叶酸缺乏的条件下变化较为显著，当到达一定浓度（1 20一24OnM）的时候，遗传稳定性变化最小。 携带BRCA了突变基因乳腺癌患者淋巴细胞株由于叶酸缺乏造成的细胞毒性与遗传毒性变化都显著增加，随着叶酸浓度的上升变化逐渐减小，均与叶酸浓度呈现出明显的负相关。在120一240nM之间，遗传损伤降到最低。.云南帅范大学硕士研究生毕业论文2.正常人类琳巴细胞株（GM12593）: 细胞毒性分析1） NDI在各组浓度没有显著性差异（p>0.05）。2）在叶酸浓度为6nM、1 ZnM、60nM和1 20nM的Apo频率和Nee频率明显的高于24haM和226onM的（p<0.05），且240 nM与2260nM之间的APo频率和Nec颂率没有显著性差异（P>0.05）。也表明Apo和Nee在24onM的叶酸浓度下已降到最低。叶酸浓度与APo、Nec呈现出负相关（rsIs=一0.353;加ucRosls=一0 .443）。 细胞遗传毒性分析:l）在叶酸浓度为6nM时双核细胞的MN频率明显高于其它剂量组。总体上随着叶酸浓度在培养基中的上升双核细胞MN频率逐渐下降。GM 1 2593的MN频率与叶酸剂量之间表现出负相关（。一0.495）。2）随着培养基中叶酸浓度的上升双核细胞的NPB频率逐渐降低，但没有显著性（P>0.05），除了在2260 nM与6 nM、12 nM、60 nM、120 nM剂量组之间的NPB频率有显著性差异（P<0.05）。3)在叶酸浓度为6nM时双核细胞的BU吞频率明显的高于2260 nM的。在叶酸浓度为240nM时BUD频率降到和正常一样（p>0.05）。4)GM12593的MN、NPB及BuD频率与叶