大豆细菌性斑点病是我国尤其是北方大豆产区的一种重要病害,给农业生产带来巨大损失,其病原物为丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv. glycinea)是世界范围内重要的植物病原细菌。同其他革兰氏阴性植物病原细菌一样,大豆细菌性斑点病菌可以在非寄主植物和抗病植物上激发过敏反应(hypersensitive response, HR),在感病寄主上具有致病性(pathogenicity),这一特性由细菌中hrp基因簇决定。hrp基因簇的特定基因编码产物harpin是一类可以在非寄主植物上激发HR的非特异性蛋白激发子,是目前研究得较为深入的一类细菌分泌蛋白。目前,对于大豆细菌性斑点病菌harpin蛋白编码基因hrpZ的功能研究甚少,国外只在Race4和Psg r0菌株中克隆和表达harpin蛋白。国内研究人员克隆并表达来自Psg12菌株中的harpin蛋白,与国外报道的hrpZ基因同源性为79%。由此,我们推断来自丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因可能存在多样性,其编码的harpin蛋白的活性和功能也可能存在差异。本实验室前期从北方大豆产区分离和鉴定了7株大豆细菌性斑点病菌,并对病原菌的Ⅲ型效应分子进行了研究。在此基础上,本文从A1和S1菌株中克隆了harpin编码基因,命名为hrpZpsgA1和hrpZpsgS1,通过生物信息学分析,确定harpinZpsgA1和harpinZpsgS1属于harpin家族第三组群,假单胞组群。并且,可将来自丁香假单胞大豆致病变种hrpZ基因分为两类,这两类hrpZ基因的核苷酸同源性为79%,氨基酸同源性为77%,均富含甘氨酸,不含半胱氨酸,富含保守的LIHEKLGDNFGASA功能序列,与假单胞菌属以外的其他革兰氏阴性植物病原细菌不存在相似性。本研究丰富了世界范围内来源于P. syringae的hrpZ基因资源,补充了我国来源于丁香假单胞大豆致病变种的hrpZ基因资源。为了了解来自A1和S1菌株harpin蛋白的生物活性和生物学功能,本研究利用GST基因操作系统获得了hrpZPsgA1和hrpZPsgS1的基因产物,分别命名harpinZPsgA1,和harpinZPsgS1,对harpinZPsgS1进行了纯化,每升BL21/pET41a(+)-hrpZPsgS1发酵液经High-Affinity GST Resin纯化,可提纯harpinZPsgS1蛋白约20mg。纯化的harpin蛋白为进一步研究其结构和功能提供了更为有利的基础。生物活性测定结果显示,harpinZPsgS1对热稳定,对蛋白K敏感,可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应,并且过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂所抑制,具备harpin蛋白的生物学特征。harpinZPsgS1激发HR的最小浓度为100μg/ml,低浓度的harpinZpsgS1虽然不能激发肉眼可见的HR,但可以激发micro-HR。外施harpinZPsgS1可以促进烟草的生长,显著提高烟草对TMV和疫霉的抗性,而且抗性不仅局限于harpinZPsgS1处理的叶片,也包括其它未处理叶片及整株植物,是一种系统获得抗性。harpinZPsgS1激发的HR伴随着HCD标志基因hsr203J, hsr515的表达,同时伴随SAR正调控因子NPR1,植保素合成限速酶基因Pal, PR蛋白家族基因PR-la、Chia5的表达,但未检测到乙烯信号通路的转录调控因子EIN2的表达,进一步说明harpinZPsgS1诱导烟草产生的SAR是依赖于水杨酸信号途径的。不同植物病原细菌产生的harpin虽然具有HR激发活性,但其在植物上的作用位点以及关键功能区域还存在一定差异。本研究为比较假单胞菌harpin类蛋白的结构和功能关系提供基础,为转基因抗病育种和新型微生物蛋白农药的研发提供基因资源。