快节奏的生活,巨大的精神压力,使得越来越多的人面临脱发的困扰。脱发不仅仅影响外观,对人的自信心也是一个十分大的打击。因此,脱发原因及治疗成为越来越多的人迫切需要解决的问题。脱发的发生与进展一般与体内雄激素的分泌有关,人体毛囊是对雄激素敏感的靶器官,其生长具有周期性,通常经历生长期、退行期和休止期三个阶段。人体分泌的雄激素主要为睾酮,睾酮在5α-还原酶的作用下转变为双氢睾酮,再与头皮部毛囊靶细胞内的雄激素受体结合,抑制毛乳头的生长发育,干扰毛囊细胞的生长代谢,使毛发提前进入休止期,从而引起脱发。此外,部分人由于遗传因素,毛囊对雄激素的敏感性较高,在正常雄性激素水平同样可引起脱发。脱发的治疗包括药物治疗和手术治疗。目前得到临床验证、医疗界认可的治脱发有效药物只有两种：口服药---非那雄胺片,外用药---米诺地尔。非那雄胺片主要针对男性脱发,也就是脂溢性脱发,作用原理是抑制雄性激素分泌,最初该药是治疗前列腺的；米诺地尔原用于心血管疾病治疗。目前除了非那雄胺片和米诺地尔,多数防脱发产品没有经过有关实验、临床证实。相比于毛发移植手术,各种药物治疗脱发都具有明显劣势：一来是药物只对轻微的脱发具有减缓作用,不能根治严重的脱发；二是容易产生耐药性、停药后症状加重以及对身体产生其它副作用。毛发移植,将先天对雄激素不敏感部位的毛囊(一般为枕部)切割分离出来,移植到秃发的部位。枕部毛发具有先天性的供区优势,其不受雄性激素及其代谢产物影响,具有稳定的生长期,不易脱落。从供区获取的毛囊移植到其它部位,成活后仍保留了枕部毛囊的特质,移植后的毛囊能够长久的生长存活。尽管疗效显著,但移植手术其本质是现有毛发在脱发区的再分布,那么患者自身需要拥有充足的供区毛发组织。对于一些严重的大面积脱发患者,这些修复技术往往无法实施。此外,患者术后脱发的进行性发展,以及供区疤痕等因素,都进一步限制了毛发移植技术的进一步开展和运用。Oliver等把大鼠触须毛乳头完全切除之后,毛乳头缺失的触须不再继续生长而脱落,这说明毛乳头对于毛囊的功能维持是必须的。随后Oliver把新分离的毛乳头移植到被切去毛球部的毛囊下,3周后新的毛发长出,而被切去毛球但未移植毛乳头的毛囊并不能长出新的毛发。这说明了毛乳头对于毛囊的生长起着根本作用,并且毛乳头细胞通过和毛囊上皮细胞的相互作用可以诱导形成新的毛发。后来科研人员们进一步研究发现毛乳头细胞除了结合毛囊上皮细胞可以诱导出毛发,和其他类型的上皮细胞,如：角质形成细胞、肾被膜等,同样可以诱导毛发生长。胚胎时期,真皮间充质细胞相互聚集,诱导位于其上方的表皮干细胞增厚形成基板,基板向真皮内延伸形成了毛囊芽,相互聚集的真皮细胞逐渐被毛囊芽所包裹进而形成毛乳头。表皮干细胞一部分转化成为毛囊的上皮细胞,另一部分发育成为毛囊干细胞,仍能够保持部分干细胞的特性。毛囊形成后,毛乳头细胞和毛囊干细胞相互作用,形成了毛发周期性的生长和脱落。基于毛发的发生机制,科研人员们进一步实验结果得出,使用具有毛发诱导能力的细胞,模拟构建胚胎时期上皮细胞和间充质细胞相互反应的内环境发育模型,可以诱导毛发组织的形成。毛发重建技术,使用重建毛发组织替代自体毛发移植物,有望在未来成为治疗脱发的细胞学疗法。毛发重建的动物模型主要有：小室法,皮瓣法,注射法等。小室法在1993年由Lichti报道并在2008年对此模型进一步改进,在裸鼠背部体表做一切口并置入小室,将具有毛囊诱导能力的细胞移植入小室内,一周后将小室拆除,3周后创面逐渐愈合,新生毛发长出。此模型所重建毛发数量可观、视觉效果好,但对组织创伤较大、细胞需要数量多,因此仅限于动物实验以及毛发发生机制、毛囊细胞诱导能力的研究。为了实现更为简洁、快速的毛发重建,Zheng等人建立了"Hair Patch Assay",即通常所说的“注射法”。通过将诱导细胞混悬液直接注射入裸鼠皮下,进而诱导形成毛发组织。简单可行,且对动物创伤较小,是未来较有希望运用于治疗人类脱发的技术。但此方法的缺点在于,毛发在皮下诱导形成后不具备正常毛发组织的极性,且无发长出体表,为了实现诱导毛发组织有序合理的分布于体表,此模型有待进一步完善。本实验中,在原有动物模型的基础上,我们对其进一步改进,以期能够在“微创”的条件下进行毛发重建,最终得到符合正常生理结构和外观的毛发组织。目的：1.建立新生C57小鼠毛囊诱导细胞分离和鉴定方法2.使用内置小室模型进行毛发重建3.以注射法进行毛发诱导并结合FUT(毛囊单位移植)技术,实现毛发方向和密度的定向重建方法：1.毛囊诱导细胞的分离、培养和鉴定出生1天内的C57鼠,在装有75%的酒精中浸泡30s后取出置于培养皿中,剪去尾巴和四肢后剥离剩余皮肤,PBS(含1%青链霉素)清洗3次。将剥离的全层皮肤置于一新培养皿,加入0.1%dispase酶,37℃消化1.5小时,将表皮和真皮分离并分别剪碎,0.2%胶原酶37℃消化30min,每10分钟吹打振荡一次。随后加入DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清),200目筛网过滤,去除组织碎片和细胞团块,收集滤液于离心管,1200r/min离心5min,弃上清液,分别得到真皮和表皮细胞的沉淀。加入DMEM高糖培养基重悬,将真皮细胞和表皮细胞以2：1的比例混合,调整细胞浓度为1×106/μL,150μL为一单位,备好细胞悬液待使用。按上述方法得制的真皮细胞沉淀,重悬后接种于培养皿中,24小时后观察免疫组化检测碱性磷酸酶,免疫荧光检钡Versican等与毛囊诱导能力相关标记。2.内置小室法毛发重建的研究取1.5ml离心管,剪下盖子并将中心挖空,打磨光滑,高温高压消毒备用。裸鼠使用10%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉,成功麻醉后背部常规消毒,靠近尾侧做一横行切口长约1cm。皮下钝性分离出一腔隙,将小室由切口处置入此腔中,缝合切口使内置的小室固定。随后将已备好的细胞悬液注射于皮下小室内,7天后剪开表皮取出内置小室,创面旷置待其自然愈合。每日大体观察皮肤愈合与毛发生长情况并取材组织学观察毛囊结构3.注射法毛发重建后结合FUT进行毛发的再分布裸鼠麻醉消毒,将制备好的毛囊诱导细胞悬液注射于裸鼠背部,2周后将皮下诱导形成的毛发组织取出,体式显微镜下分离得到“毛囊单位”,模拟FUT过程移植至裸鼠背部体表。术后观察移植毛囊的生长与毛发的周期性特点,随后取材行组织学观察。结果：1.将分离的真皮制备而成的细胞混悬液接种于培养皿中,24小时后观察贴壁。48小时后细胞融合程度达60%,甲醛固定清洗后行免疫组化、免疫荧光检测,可见Versican、AKP呈阳性表达。2.诱导细胞移植入裸鼠背部内置的小室中,7天后剪开表皮取出小室,可见小室下方形成带有黑色素沉积的皮肤组织。随后的5-10天中,创面逐渐愈合,大量毛发长出体表。组织学检测可见正常毛囊结构。3.诱导细胞直接注射到裸鼠皮下,2周后皮下形成异位毛发组织,轻微剥离并取出皮下毛发组织,在体视显微镜下分离为“毛70囊单位”随后移植于裸鼠背部,移植的毛发逐渐脱落而2周后新生毛发长出,密度与方向均符合预期,并具有毛发生长特有的周期性特点。组织学检测可见正常毛囊结构。结论：1.毛乳头和真皮鞘内的细胞,是特殊的间充质细胞,具有某些特异性标记。尽管许多蛋白marker的功能尚不清楚,但这些标记已经被广泛用于毛乳头和真皮鞘细胞的鉴定,以及毛发诱导能力的鉴定。多功能蛋白聚糖(Versican)、碱性磷酸酶(AKP)特异表达于毛乳头细胞,有研究证实表达这些标记的细胞与诱导毛发形成的能力相关。分离消化得到的真皮间充质细胞经培养24小时后,免疫检测Versican、AKP的表达呈阳性,说明此时细胞仍具有毛发诱导能力。2.内置小室模型能够成功进行毛发重建,与传统的小室法相比,其创面小、恢复快、感染率低,受外界环境因素的影响也较小,是更为优化的毛发诱导模型。此外,毛发重建的同时在创面形成了新生的皮肤组织,我们推测这是由于诱导细胞首先形成了带有毛囊等附属器官的皮肤组织,进而毛发开始进一步发育生长。3.通过FUT的技术,我们实现了重建毛发组织在裸鼠体表的再分布,达到了所期待的毛发生长密度和方向。移植后的毛发成活后具有正常的生理结构和毛发生长的周期性特点,与正常毛发组织无异。因此,将毛发重建技术与FUT技术结合,有望在未来成为临床中治疗脱发的新方法。