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研究背景及目的 人类白细胞抗原(HLA)是迄今发现的人类最复杂，最具多态性的遗传系统。2001年2月召开的十三届国际组织相容性专题会议确定已发现的HLA等位基因已达到1340个。HLA系统在抗原识别与呈递、免疫应答与调控等方面起着极其重要的作用，是影响器官移植物长期存活和造血干细胞移植成败的关键因素之一。现阶段HLA分型，临床上多采用血清学分型方法。但血清学方法不仅存在着广泛的交叉反应和难以找到理想的抗血清而出现技术上的困难和分型判断误差，还会有许多新发现的等位基因却缺乏相应的标准抗血清，导致个别基因型无法检出。以1996年第12届国际组织相容性专题研讨会为标志，HLA的分型技术全面进入DNA分型阶段。 现今国际上较常采用PCR-SSP和PCR-SSOP对HLA单个等位基因位点分型，其准确性虽优于血清学方法，但操作极为繁琐，不适合大样本检测。基因芯片是近年发展起来的一种具高通量、集成化为特点的检测平台，其优势极其适合多态性复杂的HLA系统分型研究。目前国内外此方面的报道诸多，但尚没有成熟的HLA分型芯片问世。本研究使用本实验室建立的技术流程制作寡核苷酸芯片，对HLA-DQA1位点进行等位基因分型检测，旨在建立一套成熟的寡核苷酸芯片分型技术，用于复杂的HLA系统的分型研究。 材料与方法 1．人全血基因组DNA的提取 采用改良的酚/氯仿法，以分光光度法检测提取的基因组DNA的浓度及纯度 2．样本靶序列的PCR扩增 在HLA-DQA1第二外显子保守区域设计一对引物，并在正义链引物5’作FITC标记，以荧光标记单链为优势链，行不对称扩增。 3．寡核苷酸探针的制备 根据GenBank数据库新近公布的HLA-DQA1等位基因序列，设计四组共16条特异性寡核苷酸分型探针，并在各5’端做氨基修饰。以预先摸索的优化条件重悬冷冻干燥的探针。 4．基片的处理和制备 取盖玻片，铬酸洗液中浸泡过夜，洗净，NaOH浸泡，丙酮化，手臂分子连接，清洗，烘烤固定，醛基修饰。 5.寡核昔酸微阵列的制备以同等浓度的反义链引物咫作为阳性对照，以探针缓冲液作为空白对照，以无关探针作为阴性对照，与制备好的16条寡核昔酸探针，同时加人384孔板。使用生物芯片点样仪，制成预先设计好的微阵列。点样后水化、烤干固定，备用。 6.封闭与核酸分子杂交按本室方法，将制备好的寡核昔酸微阵列，清洗，封闭。PCR产物加杂交液稀释混匀，覆盖于各微阵列，置人杂交舱中55℃保温3Omin。 7.洗涤与检测分析取出杂交芯片，冲去盖片。用预热至60℃的洗液，即1 xSSC/0.1%SDS，O.sxSSC/0.1%SDS，0.lxSSC行梯度洗涤，ddHZO洗净吹干。扫描仪检测，CCD成像系统分析杂交信号，确定分型结果。结果 1.HLA一DQAI基因片段的PCR扩增 以提取的全基因组DNA为模板，行PCR扩增，产物用聚丙烯酞胺凝胶电泳检测，可见条带清晰，产物长度538bp，与设计相符。 2.寡核昔酸探针制备条件的优化 以PH二9，0.IM的碳酸盐缓冲液，重悬为100林M探针为最优条件。 3寡核营酸芯片分型结果的准确性与稳定性 分型结果与DNA测序相符合，重复5次杂交重现率91 .2%。结论 基甲芯片作为一种新兴的检测技术平台，具有明显的高通量、集成化并行检测的优势，且结果直观，易于保存和携带，非常适合组成复杂的HLA系统的分型检测。有关文献提示，本室研制的寡核昔酸芯片制作流程相对简单，易于操作，且稳定性好，特异性和灵敏性都能满足基因分型的需要，是适合广泛应用的技术平台。