论文部分内容阅读
肝纤维化是肝脏受到各种慢性损伤的愈合过程，表现为细胞外基质(ECM)生成超过它的降解。如果早期没有得到有效的治疗，可逆性肝纤维化就会发展成为不可逆的肝硬化。肝纤维化是各种慢性肝病共同的病理过程。肝星状细胞(HSC)的激活是肝纤维化形成的中心环节，正常时HSC呈静息及非增殖状态，但在肝组织损伤的情况下，HSC激活并转变为肌成纤维细胞，细胞大量增殖和ECM的合成增加并沉积，最终导致肝纤维化的发生。姜黄素是姜黄属植物姜黄根茎的活性成分，具有抗增殖、抗氧化、抗炎、抗血管生成和抗癌作用。文献报道姜黄素可以显著抑制HSC活化，减少细胞增殖，诱导细胞凋亡及抑制ECM基因表达，但其确切的作用机制还不十分明了，若能阐明其关系，有助于使姜黄素成为有潜力的以HSC为靶点的抗肝纤维化备选药物。第一部分姜黄素诱导活化肝星状细胞凋亡和抑制细胞外基质基因表达的作用依赖于过氧化物酶增殖因子活化受体-γ的激活目的：研究姜黄素对活化HSC中PPARγ的激活在诱导细胞凋亡和抑制ECM基因表达过程中的作用及其机制。方法：传代的HSC细胞按实验设计方法处理后，进行蛋白质印迹法(Western blotting)分析，Caspase3活性测定，流式细胞仪分析凋亡HSC，实时PCR(Real-time PCR)检测，质粒及瞬时转染分析，TGF-β1免疫测定。结果：PPARγ的激活介导了姜黄素抑制cyclin D1的表达，而cyclin D1表达的抑制又促进PPAPγ的激活，姜黄素还通过刺激体外活化HSC中Caspase3活性、增加促凋亡Bax数量和降低抗凋亡Bc1-2水平而促使HSC细胞凋亡。此外，PPARγ的激活是姜黄素抑制ECM基因表达所必需的，PPARγ的激活通过抑制转化生长因子β(TGF-β)受体介导了姜黄素阻断TGF-β信号传导通路。结论：姜黄素激活体外活化HSC中PPARγ的活性，从而起到抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡及抑制ECM基因表达的作用。第二部分姜黄素抑制结缔组织生长因子基因的表达而抑制活化肝星状细胞中细胞外基质基因的表达目的：研究姜黄素抑制活化的HSC中α1(Ⅰ)型胶原基因[a1(Ⅰ)collagen]表达机制。方法：传代的HSC细胞按实验设计方法处理后，进行Westernblotting，Real-time PCR检测，质粒及瞬时转染分析，GSH免疫测定。结果：姜黄素能减少活化HSC中结缔组织生长因子(CTGF)并抑制它的基因表达。外源性CTGF能消除姜黄素的抑制效应。姜黄素通过激活过氧化物酶增殖因子活化受体(PPAR-γ)来抑制CTGF基因表达而阻断转化生长因子(TGF-β)信号。姜黄素抗氧化活性是通过显著升高谷胱甘肽(GSH)水平和活化的HSC中GSH与GSSG的比例。细胞GSH合成是姜黄素阻断TGF-β信号和抑制活化HSC中CTGF及a1(Ⅰ)collagen基因表达的先决条件。结论：姜黄素抑制活化HSC中a1(Ⅰ)collagen基因表达是通过增高细胞GSH含量和阻断TGF-β信号并抑制CTGF基因表达第三部分姜黄素干扰转化生长因子-β信号传导从而诱导大鼠肝星状细胞中过氧化物酶增殖子活化受体-γ的基因表达目的：研究在HSC中PPAR-γ活化与TGF-β信号传递相互拮抗作用的机制。方法：传代的HSC细胞按实验设计方法处理后，进行Western blotting，Real-time PCR检测，质粒及瞬时转染分析，位点定向突变实验，电泳迁移率移动分析(EMSA分析)。结果：外源性的TGF-β抑制活化HSC中PPAR-γ基因的表达，但姜黄素的预处理会完全阻止此抑制作用，其作用机制可能是通过干扰TGF-β信号转导。转染实验进一步表明用显性负相PdnTGF-RⅡ受体阻断TGF-β信号转导会增加PPAR-γ基因启动子活性。启动子缺失检测，位点定向突变和凝胶移动检测将姜黄素的反应位点集中定位于PPAR-γ基因启动子上的两个Smad结合元素(Smad binding elements，SBEs)，负向调节传代的HSC启动子的活性。Smad3／4蛋白复合体特异地与SBEs相连，过量表达的Smad4剂量依赖性地抵消姜黄素对PPAR-γ基因启动子诱导和TGF-β信号转导的抑制作用结论：在活化的HSC中TGF-β反向调节PPAR-γ基因表达，由姜黄素诱导的活化HSC中PPAR-γ的基因表达有可能，至少是部分由于姜黄素对于TGF-β信号转导的干扰