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中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)或NETosis是在感染或炎症应答期,活化的中性粒细胞向胞外释放自身染色质DNA和组蛋白,从而形成的网状支架,是参与癌栓形成及其介导的肿瘤血行转移的关键环节之一。近年来研究发现,烟酰胺腺嗓呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)可催化活性氧自由基(reactive oxygen specie,ROS)激活下游信号通路应答,此为抑制NETs产生的早期分子事件。肽基精氨酸脱亚氨酶4(protein-arginine deiminase 4,PAD4)可催化NETosis的生物标志物瓜氨酸化组蛋白H3(citrμilinated histone H3,CitH3)的形成。因此,NOX、PAD4、中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)所构成的酶环境是NETosis的效应器。中药丹参(Salviamiltiorrhiza),药性微寒,味苦,归心、肝经,无毒,具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神等功能。丹参抗炎、抗氧化和抗凝血活性显著,临床上用于保护心脑血管并治疗心脑血管疾病。肿瘤患者易发生静脉血栓栓塞(venous thromboembolism,VTE)风险,是重要的致死因素之一。因此,作为活血化瘀药代表,丹参是临床中晚期肿瘤血瘀证患者治疗方剂中的重要配伍用药。丹参中的活性成分主要为亲水性芳香酸类成分和亲脂性丹参酮类成分。代表性的芳香酸类成分包括咖啡酸(caffffeic acid,CA)、丹参素(Salvia miltiorrhiza su,DSS)、迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)和丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B);而丹参酮类化合物主要包括丹参酮Ⅰ(tanshinone Ⅰ,Tan Ⅰ)、丹参酮 ⅡA(tanshinone ⅡA,Tan ⅡA)、隐丹参酮(cryptotanshinone,CPT)和二氢丹参酮 Ⅰ(15,16-dihydrotanshinone I,DHTI)。为了研究肿瘤血瘀证与肿瘤转移的关系,深入开展活血化瘀药对肿瘤转移的影响及机理研究,本论文以中药丹参作为研究对象,以丹参整体效应即丹参注射液(Salvia miltiorrhiza injection,DSI)、丹参活性成分即DHTI与Sal B及丹参活性成分群(DHTⅠ联合Sal B)为代表,以NETosis现象为切入点,从有效性验证到靶标筛选再到丹参整体及其活性成分群的药理机制开展探索。本论文共分为四个章节。第一章:在体内建立实验性胃癌血行转移模型,利用小动物活体成像系统观察丹参对癌栓形成与胃癌转移的影响,组织学技术分析荧光转移组织血管周围NETs生物标志物的表达,酶联免疫吸附试验检测小鼠凝血前状态,研究丹参体内抗胃癌血行转移的药效学;第二章:体外建立佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导的NETs模型,通过DNA探针对中性粒细胞胞外DNA释放荧光定量分析以及生物标记物多重免疫荧光定性分析筛选出衍生自丹参的亲水性和疏水性部分的代表性活性化合物;第三章:根据体外筛选结果,利用免疫印迹技术分析丹参单体成分对中性粒细胞瓜氨酸化组蛋白与总瓜氨酸蛋白水平的影响,使用商品化试剂盒测定丹参单体成分对中性粒细胞NOX、PAD4、NE、MPO酶活性以及中性粒细胞、肿瘤细胞NOX酶活性的影响,确证丹参单体成分抗NETs的分子靶点;第四章:采用荧光定性和定量技术及流式细胞术分析丹参及其活性单体本身对NETs及中性粒细胞凋亡的影响,而后利用定量药理学模型分析丹参活性成分间的相互作用,对丹参抗NETs活性的整合效应进行研究。因此,本论文在确证丹参抑制肿瘤血行转移的基础上,以丹参整体效应(丹参注射液)、丹参活性成分(DHTI、Sal B)及丹参单体活性成分群(DHT I联合Sal B)为代表,阐明丹参通过抑制NETs发挥多成分多靶点的抗肿瘤效应。