研究背景膝关节骨性关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)是老年人中的常见病和多发病,严重损害患者身心伤害,同时给社会带来了巨大的经济负担。KOA主要表现为膝关节慢性疼痛、活动障碍甚至残疾,而难以忍受的慢性疼痛往往是患者就医的主要原因。目前,KOA慢性疼痛的药物治疗效果不佳,且患者长期用药易产生耐药及严重的副作用。KOA后期,患者不得不选择进行膝关节置换术来改善关节的功能、缓解疼痛。然而,全膝关节置换术(total knee replacement,TKR)后6个月内,仍有16%-39%的患者存在膝关节疼痛。因此,目前针对KOA后期慢性、难治性疼痛缺乏行之有效的治疗方法,患者只能长期忍受慢性疼痛带来的身体上和精神上的折磨。除此之外,相关的研究还表明膝关节痛还会使得患者的死亡率增高。基于患者对KOA慢性疼痛有效治疗方案的迫切需求,临床研究人员也渐渐开始关注KOA慢性疼痛,KOA慢性疼痛的发病机制及治疗方案的研究也渐渐成为研究的热点。临床研究发现,患者疼痛的严重程度及持续时间与关节内部的病理改变不成正比。进一步的研究证实,疼痛相关中枢神经系统的改变相比于外周因素在KOA慢性疼痛发生和发展过程中发挥着更为重要的作用。目前,临床上已经尝试通过对神经系统的干预来治疗KOA患者后期产生的慢性难治性疼痛。因此,探索KOA导致的慢性疼痛的中枢发病机制也许能够为我们找到KOA慢性疼痛治疗的理想靶点。核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一种重要的核转录因子,在免疫和炎症反应、细胞的分裂和凋亡过程中发挥着必不可少的作用。除了发挥上述重要作用外,在神经系统中NF-κB还能够参与到学习、记忆和疼痛的形成过程中。多项研究发现,在脊髓甚至是更高级别的中枢神经系统内炎症、创伤等刺激因素本身及随之产生炎症因子、神经递质和神经营养因子均可导致NF-κB信号通路的激活。NF-κB信号通路的激活又可以使进一步的导致脊髓内炎症反应加重、神经递质释放量增加以及离子通道功能改变,进而导致疼痛程度加剧。当刺激因素持续存在,NF-κB信号通路处于长期激活状态,脊髓背角内炎症慢性化、神经递质受体大幅度增加,甚至导致神经元及神经胶质细胞产结构性的改变,产生慢性、难治性及神经病理性疼痛。NF-κB二聚体是其最常见的活性状态,p50/p65是最常见的二聚体形式,其中主要由p65与目的基因结合因此我们选择NF-κB/p65作为我们的研究对象。前期研究已证实,干扰脊髓内NF-κB/p65的表达能够减轻风湿性膝关节炎的疼痛程度,同时还能够改善外周炎症反应。然而,在主要表现为慢性退行性病变而非炎症反应的骨性关节炎中NF-κB/p65是否能够发挥同样的作用却未见报道。本研究将在以碘乙酸钠(monosodium iodoacetate,MIA)建立的KOA大鼠模型上,对NF-κB/p65在KOA导致的慢性疼痛及关节破坏的进展速度上所发挥的作用进行研究。研究目的本研究目的是通过关节内注射MIA建立的KOA大鼠模型,探索脊髓内NF-κB/p65信号通路在KOA导致的疼痛敏感的形成过程中的作用及其机制。研究方法1、采用随机数字法将健康的雌性SD大鼠为三组:对照组、KOA模型组和NF-κ B抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)鞘内给药的KOA模型组,每组50只。自大鼠关节腔内注射MIA完成当天起,每天鞘内给予大鼠PDTC 12μl(0.2mg/ml)直至相应时间点。2、MIA注射前1d和注射后7d、14d、21d和28d通过检测50%缩足阈值(paw withdrawal threshold,PWT)对大鼠的机械痛域进行检测。于相同时间点,通过直接拍照和制作病理切片的方法对大鼠关节面肉眼及显微镜下的病理学改变进行观察和评估;采用Western blot技术、免疫荧光技术和RT-PCR(real-time polymerase chain reaction)技术检测大鼠脊髓内NF-κ B/p65的蛋白量和转录水平的变化;采用 RT-PCR检测 IL-1β(interleukin-1β)、IL-33 和 TNF-α(tumor necrosis factor-α)的转录水平的变化趋势。结果MIA注射后,KOA模型组大鼠膝关节的痛觉敏感程度逐渐增加,并于14d到达高峰后维持在较高水平;关节面破坏程度不断加重、关节间隙逐渐变窄,符合临床上KOA的变化特点。脊髓内NF-κB/β65的蛋白水平和mRNA水平与大鼠痛觉敏感程度的变化趋势一致,脊髓内IL-1β、IL-33和TNF-α的转录水平逐渐增加,峰值与NF-κB/p65一致。鞘内注射PDTC模型组MIA注射后21d起痛觉敏感程度较模型组明显降低,向KOA模型大鼠鞘内注射PDTC后大鼠脊髓内NF-κB/p65的蛋白水平和mRNA水平较模型组明显降低。鞘内注射PDTC模型组大鼠MIA注射后28d时脊髓内的IL-1 β、IL-33和TNF-α转录水平较模型组也明显降低。结论骨性关节炎导致脊髓背角内NF-κB/p65蛋白和mRNA的表达量的上调;鞘内注射阻滞剂PDTC能够下调脊髓内NF-κB/p65蛋白和mRNA的表达量,并且在KOA中后期能够降低大鼠的痛觉敏感程度。结果表明,脊髓内NF-κB/p65在KOA中后期产生的痛觉过敏中发挥着重要的作用。此外,下调脊髓内NF-κB/p65还能抑制IL-1β、IL-33和TNF-α在KOA中后期的过表达。在骨性关节炎的进展的后期,脊髓内NF-κB/p65增加了大鼠的痛觉敏感程度有可能是通过上调IL-1β、IL-33和TNF-α的表达量而导致的。