结核病(Tuberculosis ,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所致以呼吸系统感染为主的慢性传染病。近年来,由于卡介苗(BCG)保护效果不佳,耐药MTB菌株的出现,艾滋病的流行以及人口流动的增加等使得TB又卷土重来,成为危害人类健康的传染病的第一杀手。BCG是目前预防TB的唯一疫苗,但其不能有效预防成人TB,因此研究更为有效的TB新型疫苗对TB的防治有着重要的意义。MTB热休克蛋白65(HSP65)是MTB感染过程中的重要免疫保护性抗原之一。研究表明,用编码该蛋白的重组质粒免疫小鼠,可以明显减少感染小鼠的脾肺荷菌数;用编码该蛋白的重组质粒肌肉注射化疗后的感染小鼠,可以有效清除小鼠体内的持留菌。细胞因子IL-2是一种很好的免疫佐剂,其不仅可增加机体的免疫应答,而且可以介导免疫反应向Th1型方向发展,而该型的免疫反应对控制MTB感染起着关键作用。实验目的:构建可表达HSP65-IL-2融合蛋白的DNA疫苗以及重组耻垢分枝杆菌(rM.S)疫苗,并与BCG相比较,评价这两种疫苗在小鼠体内的免疫学特性和抵抗MTB感染的保护力,以期寻找有效的预防和治疗TB的新型疫苗。实验方法和结果:1. HSP65-IL-2融合蛋白的表达及纯化采用PCR方法从MTB H37Rv株DNA基因组中分两段扩增HSP65基因,并先后与pMD18-T载体连接,得到完整的全长基因,经测序证实与Genebank公布的MTB HSP65基因序列完全一致。利用PCR方法从含有hIL-2基因的pGEM-Teasy-IL-2质粒中扩增IL-2基因,利用引物设计在IL-2基因的上游引入一段48bp的疏水性linker。测序证实成功地在IL-2基因上游引入序列正确的linker,且IL-2基因序列也完全正确。将HSP65和IL-2基因按照相应的酶切位点克隆入pMD18-T载体,得到HSP65-IL-2融合基因,并将其亚克隆入pPRO EX HTa原核表达载体,酶切鉴定阳性重组质粒pPRO-hsp65-IL-2,并用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明成功地表达了HSP65-IL-2融合蛋白;用抗人的IL-2 mAb进行Western-blot证实,其大小为78kD,与预计的蛋白大小相符。用Ni-NTA亲和色谱柱纯化获得了目的蛋白。2. HSP65-IL-2融合基因真核表达载体的构建及其表达利用酶切位点将HSP65-IL-2融合基因从pPRO-hsp65-IL-2中亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),酶切鉴定阳性重组质粒pcDNA-hsp65-IL-2。将重组质粒用脂质体瞬时转染COS-7细胞和稳定转染P815细胞。间接免疫荧光检测表明,HSP65-IL-2融合基因的真核表达载体可在转染细胞内成功地表达目的蛋白,且其稳定转染的P815细胞在G418压力筛选下获得了可稳定表达目的蛋白的P815细胞系。3. HSP65-IL-2融合基因DNA疫苗刺激小鼠的免疫应答将HSP65-IL-2融合基因的真核表达重组质粒DNA(1μg/μl)肌肉注射免疫小鼠,每次100μl/只,间隔2周免疫一次,共免疫3次,同时设BCG和生理盐水对照组。第三次免疫后4周,测定小鼠体内的体液和细胞免疫反应。结果DNA疫苗诱导小鼠体内产生的平均抗体滴度为1:16,000,明显高于BCG免疫组的1:4,000,且抗体亚类以Th1型的IgG2a为主(P<0.01)。在细胞免疫应答中,DNA疫苗组小鼠的脾淋巴细胞特异性增殖明显,指数为2.2,显著高于BCG组的增殖指数1.9(P<0.05);DNA疫苗组的IFN-γ和IL-2水平分别为170.62±8.53pg/ml和37.59±1.88pg/ml ,明显高于BCG组的120.24±6.01pg/ml和34.25±1.71pg/ml(IFN-γ,P<0.01;IL-2,P<0.05);DNA疫苗可使CD4+T细胞和CD8+T细胞明显增殖,所占百分比分别为22.8%和11.2%,但仍低于BCG免疫小鼠的37.3%和12.8%(P<0.05)。以稳定表达HSP65-IL-2融合蛋白的P815转染细胞为靶细胞,检测DNA疫苗和BCG免疫小鼠后产生的CTL效应。结果DNA疫苗诱导产生的CTL杀伤活性当效靶比为100:1时达93.5±4.7%,明显高于BCG诱导产生的CTL杀伤活性46.7±2.2%(P<0.01)。4. HSP65-IL-2融合基因DNA疫苗对MTB感染小鼠的预防保护效果小鼠免疫完成后,用0.2mg/100μl的MTB H37Rv毒株尾静脉感染,6周后,无菌分离小鼠的脾肺,计数脾肺组织的细菌荷菌数,以log10CFU表示。结果表明,生理盐水对照组小鼠的脾肺荷菌数分别为5.90±0.30log10和5.78±0.29log10,DNA疫苗组小鼠的脾肺荷菌数分别为4.56±0.23log10和4.34±0.22log10,其减少的差值分别为1.34log10和1.44log1(0P<0.01),提示DNA疫苗对MTB感染小鼠有明显的保护作用;但保护作用尚不如BCG(P<0.05),后者免疫小鼠的脾肺荷菌数分别为4.20±0.21log10和3.90±0.19log10,减少的差值分别为1.70log10和1.88log10(P<0.01)。5. HSP65-IL-2融合基因DNA疫苗对MTB感染小鼠的治疗效果每只小鼠经0.2mg/100μl MTB H37Rv毒株尾静脉感染4周后,再给小鼠肌肉注射重组质粒DNA(1μg/μl),每次100μl/只,间隔2周注射一次,共注射3次,同时设BCG和生理盐水对照组。末次注射后6周,无菌分离小鼠的脾肺,计数脾肺荷菌数,以log10CFU表示。结果表明,MTB感染小鼠再注射生理盐水对照组的脾肺荷菌数分别为6.50±0.33log10和6.38±0.32log10,而注射质粒DNA组小鼠的脾肺荷菌数分别为6.24±0.31log10和6.00±0.30log10,分别减少了0.26log10和0.38log10(P<0.05),提示质粒DNA对MTB感染小鼠有一定的治疗作用,但这种作用弱于注射BCG的对照组,后者的脾肺荷菌数分别为5.90±0.30log10和5.86±0.29log10,减少的差值分别为0.60log10和0.52log10(P<0.01)。6.分泌表达HSP65-IL-2融合蛋白的rM.S疫苗的构建和表达将HSP65-IL-2融合基因亚克隆入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体,构建可分泌表达HSP65-IL-2融合蛋白的重组质粒pDE22-hsp65-IL-2,并酶切鉴定。将重组质粒电穿导入M.S感受态细胞,经潮霉素抗性筛选rM.S阳性克隆。阳性rM.S经PCR特异性扩增目的基因片段,证实rM.S中含有目的基因。将rM.S扩大培养,收集培养上清,用HSP65-IL-2融合基因DNA疫苗免疫小鼠的抗血清进行Western-blot分析,结果证实有特异性反应的蛋白条带,其大小与预期分子量一致;用该血清对rM.S进行间接免疫荧光鉴定,也发现有特异性反应的绿色荧光,表明rM.S中含有目的蛋白并能分泌表达。7. rM.S疫苗刺激小鼠的免疫应答每只小鼠皮下免疫0.2mg/100μl的rM.S或BCG,在免疫后1周和4周时,检测这两种疫苗在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫反应。结果表明,rM.S免疫小鼠1周后就可产生较高的抗体水平,滴度为1:4,000,明显高于BCG组的1:200(P<0.01),而且抗体亚类以Th1型的IgG2a为主;rM.S免疫4周后,小鼠体内的抗体水平下降,且抗体亚类转为以Th2型的IgG1为主;用BCG对小鼠进行同样的免疫和观察,其抗体水平一直很低,处于IgG1/ IgG2a相对平衡状态。细胞免疫应答的检测同样发现rM.S在免疫小鼠1周后产生的免疫反应强于其免疫4周后产生的。在免疫1周后,rM.S诱导的特异性脾淋巴细胞增殖指数为6.21,明显高于同期BCG免疫组的3.33和生理盐水对照组的1.01(P<0.01);其诱生的IFN-γ和IL-2的水平分别为115.00±4.11 pg/ml和27.41±3.67pg/ml,明显高于生理盐水组的57.42±2.87pg/ml和9.53±1.32pg/ml(P<0.01),而且IFN-γ水平也高于同期BCG免疫组的99.37±8.87pg/ml(P<0.05),但IL-2的水平与BCG免疫组的31.21±2.87pg/ml相当(P>0.05);其刺激的脾淋巴细胞CD4~+T细胞和CD8~+T细胞所占百分数值分别为50.4%和14.7%,均明显高于生理盐水对照组的20.5%和8.7%(P<0.01),且其CD4~+T细胞数量明显多于BCG免疫组的43.2%(P<0.05),而CD8~+T细胞数与BCG免疫组的14.2%相当(P>0.05);其刺激的CTL杀伤活性当效靶比为100:1时达84.2±4.2%,明显高于BCG免疫组的38.9±1.9%和生理盐水组的22.3±2.1%(P<0.01)。免疫4周后,rM.S诱导的特异性脾淋巴细胞增殖指数为1.91,与此时BCG免疫组的2.01相当(P>0.05),但仍高于生理盐水组的1.15(P<0.05),rM.S免疫组和BCG免疫组小鼠的特异性脾淋巴细胞增殖指数均比其免疫1周后的指数低(P<0.05);rM.S免疫组的IFN-γ和IL-2的水平下降到82.84±3.36pg/ml和16.62±2.02pg/ml,低于其免疫1周时的水平(P<0.05),也低于此时BCG免疫组的水平117.60±7.91pg/ml和30.50±4.63pg/ml (P<0.05),但仍高于生理盐水组的59.03±2.95pg/ml和10.20±1.51pg/ml(P<0.05);rM.S免疫组的CD4~+T细胞百分比27.0%,仍高于BCG免疫组的24.2%和生理盐水组的20.5%(P<0.05),但CD8~+T细胞百分比6.8%低于生理盐水组的8.7%(P<0.05),与BCG免疫组的4.8%相当(P>0.05),此时rM.S免疫组的CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的总和仍高于生理盐水组(P<0.05),而BCG免疫组的CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的总和与生理盐水组相比没有显著性差异(P>0.05),rM.S和BCG免疫组的CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的百分比及其总和明显低于它们免疫1周时刺激产生的CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的百分比及其总和(P<0.05);rM.S免疫组的脾淋巴细胞CTL活性当效靶比为100:1时达62.3±3.1%,仍明显高于BCG免疫组的47.5±2.3%和生理盐水组的25.4±1.3%(P<0.05),但低于其免疫1周时的活性(P<0.05),而BCG免疫组的则高于其免疫1周时的活性(P<0.05)。8. rM.S疫苗对MTB感染小鼠的预防保护效果rM.S和BCG免疫完成4周后,每只小鼠用0.2mg/100μl的MTB H37Rv毒株尾静脉感染,6周后,无菌分离脾肺组织,计数脾肺荷菌数,以log10CFU表示。结果表明,rM.S免疫小鼠的脾肺荷菌数分别为5.26±0.10log10和5.78±0.34log10,而生理盐水组的为6.08±0.15log10和6.33±0.21log10,rM.S免疫小鼠的脾肺荷菌数减少的差值分别为0.82log10和0.55log10(P<0.01),表明rM.S可有效保护小鼠抵抗MTB感染;BCG免疫小鼠的脾肺荷菌数分别为4.90±0.24log10和5.38±0.19log10,其与生理盐水组相比减少的差值大于rM.S免疫小鼠与生理盐水组小鼠的差值(P<0.05)。9.结论可表达HSP65-IL-2融合蛋白的DNA疫苗和其rM.S疫苗均可在小鼠体内刺激产生较强的体液和细胞免疫应答;而且rM.S疫苗可在免疫接种1周就达到免疫应答的顶峰,其反应强度超过了BCG诱导产生的,但这种免疫反应消退也较快。DNA疫苗和rM.S疫苗都可显著减少感染小鼠体内的脾肺荷菌数,表明其可抵抗MTB的感染,但这种保护作用尚不如BCG。今后我们将尝试以不同的免疫方法,途径和动物模型来进一步提高这两种疫苗的免疫原性和保护效果。