一、研究背景胆管癌是由多种胆管上皮分化特点细胞构成的上皮恶性肿瘤,是发病率仅次于肝细胞肝癌的第二常见的肝脏恶性肿瘤。在过去的四十年中全世界胆管癌的总发病率逐渐上升。对于胆管癌患者,手术是首选的治疗方案。然而,只有大约35%的临床就诊患者是处于肿瘤早期阶段,并且可以通过手术切除达到治疗目的。胆管癌是恶性度很高的肿瘤,由于其侵袭能力强、转移早,大部分病人确诊时已经是晚期患者,因此胆管癌预后极差。一些能够手术的患者往往也因为局部淋巴结和远处转移而疗效不佳,2年生存率低于20%。对于失去手术机会的患者系统性辅助治疗(包括传统放疗、化疗)的疗效十分有限。用常规吉西他滨联合顺铂的化疗方案后患者中位生存时间不到1年。由于胆管癌患者早期无任何临床症状,所以早期诊断非常困难。临床上目前没有一个有效的早期诊断指标,所以探索新的标志物用于胆管癌的诊断和预后评估就非常急迫了。YBOX结合蛋白-1(YBOX-1)在细胞内的表达水平与恶性肿瘤(如黑色素瘤、骨肉瘤、肺癌和乳腺癌)的进展和不良预后高度相关。YBOX-1在胆管癌中的作用引起了我们的兴趣。YBOX-1是含有冷休克蛋白序列的冷休克蛋白家族的一员。作为一种核酸结合蛋白,YBOX-1参与了转录、翻译、mRNA剪接、DNA修复、mRNA包装、染色质重建以及环境应激反应等细胞的多种生理、病理过程。YBOX-1在合成mRNA复合物和microRNA加工中也起着重要作用。在癌细胞中YBOX-1的作用尤其明显,YBOX-1调控多种重要基因、蛋白的转录、翻译和扩增,参与肿瘤细胞逃逸,在DNA拷贝复制、DNA修复、多重化疗药物耐药以及EMT中都发挥着重要作用。YBOX-1可能成为预测肿瘤预后不良的标志物和靶向治疗的靶点。关于YBOX-1的相关研究开展了一些,但是在胆管癌中的作用仍不清楚。二、研究目的1.通过调控YBOX-1表达水平是否影响胆管癌细胞侵袭、迁移及增殖能力,从而进一步明确YBOX-1在胆管癌中的作用。2.检测胆管癌患者切除肿瘤标本中YBOX-1的表达来分析YBOX-1表达情况与临床病理和患者预后情况的关系。三、研究方法1.通过蛋白质谱分析与GATA6结合的蛋白,从中筛选出与肿瘤相关的分子。通过查阅文献和预实验确定选择YBOX-1。通过双荧光素酶报告基因检测了解YBOX-1与RPSA启动子是否有结合。2.通过细胞侵袭实验和细胞迁移实验验证改变细胞YBOX-1表达后的胆管癌细胞是否出现侵袭和迁移能力的改变。3.采用裸鼠异种移植法检测细胞增殖能力。了解在活体动物体内通过转染获得的YBOX-1表达变化的胆管癌细胞移植后肿瘤增殖能力是否有变化。4.用免疫组化染色检测91例胆管癌患者切除肿瘤组织中YBOX-1表达情况。统计纳入样本患者的年龄、性别、肿瘤部位、病理分型、TNM分期(按UICC第7版标准划分)、淋巴结转移情况、血管侵犯情况、是否远处转移、生存时间及肿瘤复发时间。统计各项与YBOX-1表达情况之间的关系。统计无瘤生存时间和总生存时间,然后通过统计分析确定YBOX-1表达情况与患者肿瘤复发与生存是否有关系。四、研究结果1.蛋白质谱分析显示YBOX-1与GATA6蛋白结合。双荧光素酶报告基因检测显示YBOX-1与RPSA启动子结合。YBOX-1通过与GATA6结合形成转录复合体调控RPSA表达从而影响胆管癌细胞的生物特性。2.细胞侵袭实验和细胞迁移实验都证明:降低YBOX-1表达的QBC939 sh-YBOX-1相较于QBC939和对照QBC939 sh-Control相比侵袭和迁移能力都降低。提高YBOX-1表达的RBE ex-YBOX-1相较于RBE和对照RBE ex-Control相比侵袭和迁移能力都提高。3.裸鼠皮下肿瘤细胞移植的结果显示:降低YBOX-1表达的QBC939 sh-YBOX-1相较于对照QBC939 sh-Control增殖能力降低。提高YBOX-1表达的RBE ex-YBOX-1相较于对照RBE ex-Control相比肿瘤增殖能力提高。4.91例病例组织切片的IHC结果显示共计55例胆管癌标本YBOX-1染色为强阳性,占60.4%;36例胆管癌标本YBOX-1染色为弱阳性,占39.6%。在31例匹配的癌旁标本YBOX-1染色为阴性。YBOX-1表达强阳性的胆管癌患者5年生存率低于弱阳性患者(P=0.02)。而肿瘤的复发也与YBOX-1表达有关(P=0.03),YBOX-1表达强阳性的胆管癌患者肿瘤复发时间早于YBOX-1表达弱阳性的患者。五、研究结论YBOX-1表达水平和胆管癌细胞的迁移、侵袭、增殖能力正相关。YBOX-1的高表达和胆管癌的术后低生存率和早期复发相关。YBOX-1可能是一个影响患者生存率的危险因素和不良预后的病理学标志。YBOX-1可能成为一个新的生物标志用于胆管癌的预后评估。