论文部分内容阅读
目的：研究体外培养海马神经元的方法,观察体外培养海马神经元生长特性,并在此基础上,制备难治性癫痫细胞模型,研究难治性癫痫细胞模型中海马神经元的损伤情况,观察模型制备后神经网络的变化。方法：分离新生大鼠海马,采用添加B-27的无血清神经培养基(neurobal medium, NB)培养,倒置显微镜观察体外海马神经元的生长特性,采用神经微丝蛋白(neurofilament protein, NF)鉴定神经元。将培养至第十天的海马神经元随机分成两组：(1)难治性癫痫细胞模型组：去除维持培养液,无镁细胞外液处理3小时,恢复维持培养液继续培养。(2)对照组：去除维持培养液,正常细胞外液处理3小时恢复继续维持培养液培养。取细胞上清液测定模型组及对照组不同时间点的乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase, LDH)的释放量,在倒置相差显微镜及扫描电镜下观察模型组和对照组神经元及神经网络的形态学变化。结果：采用该方法培养的海马神经元可体外存活28天左右,培养9-14天时细胞胞体丰满,突起连成稠密的网络,为发育最成熟的阶段。第九天时神经元纯度为90%。模型组在模型制备后3h,6h,24h三个时间点LDH的释放量明显高于对照组(P<0.05),而随着时间的延长,LDH的释放量也逐渐上升。模型组经换成维持培养液培养24h后倒置相差显微镜下可见神经元互相迁移靠近,神经网络逐渐变成“网格”样,继续培养3d后部分神经元胞体相互融合,神经网络的“网格”样变化更加明显。扫描电镜下可见神经元胞膜粗糙,胞膜上可见数个小凹陷形成,神经网络聚集,交织复杂。结论：1 NB无血清培养基加B27可有效抑制非神经元的生长,所培养的海马神经元活性好,纯度高。2无镁细胞外液处理3小时制备的难治性癫痫细胞模型稳定性、持续性良好,为今后进一步研究难治性癫痫的发病机制提供了良好的体外模型。3难治性癫痫细胞模型存在神经元损伤,随着时间的延长,神经元损伤越严重。4难治性癫痫细胞模型存在神经网络的形态学变化。