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双果糖酐Ⅲ是近年来人们发现的一种新型天然功能性甜味剂,具有促进Ca、Fe、Mg、Zn、Cu等矿物质元素的吸收、增进骨骼生长、利于排尿、改善便秘及抑制蛀牙等功能,且甜度较高、能量值低,具有良好的理化性质,耐热、耐酸,适用于焙烤食品、饮料、糖果和医药制剂中。生物法制备双果糖酐Ⅲ是近年来一个研究热点,菊糖果糖转移酶可水解菊糖,生成双果糖酐Ⅲ,转化率高,方法可行,应用潜力极大。
本文从土壤中分离、筛选出一株菊糖果糖转移酶产生菌,并对其进行生理生化等性质研究,结合16SrDNA序列分析,鉴定为金黄节杆菌,命名为ArthrobacteraurescensSK8.001,保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏号为No.M207185。通过LC-MS-MS及13C-NMR进行产物鉴定,确定菊糖酶解主要产物为双果糖酐Ⅲ,少量产物为蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)等低聚果糖。
利用DTF-02型阳离子交换树脂分离纯化了酶法合成的双果糖酐Ⅲ,研究了温度、固形物含量、上样量、流速的影响,确定其最佳分离条件为:柱温60℃、流速1.0mL/min、固形物含量为20％、上样体积为5mL。。此时分离获得的双果糖酐″纯度为98％,回收率达95％以上。
研究了多种碳源对菊糖果糖转移酶诱导合成的影响,结果表明菊糖和双果糖酐Ⅲ对菌体产菊糖果糖转移酶有显著促进作用,低聚果糖可低水平诱导。详细研究并对比了菊糖和双果糖酐Ⅲ不同浓度下诱导合成菊糖果糖转移酶的过程。高浓度菊糖(30-50g/L)不抑制菌体生长,不阻遏菊糖果糖转移酶合成;30g/L以上双果糖酐Ⅲ浓度抑制菌体生长,阻遏菊糖果糖转移酶合成。
粗酶液经乙醇沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow离子交换色谱和Superdex200凝胶过滤等步骤,获得的菊糖果糖转移酶经SDS-PAGE电泳,显示为单-谱带;结合SDS-PAGE和排阻凝胶色谱的测定结果,表明A.aurescensSK8.001菊糖果糖转移酶是单亚基蛋白,分子量约40kDa。
对菊糖果糖转移酶的酶学性质进行了全面的研究。发现该酶最适反应pH为5.5,在pH4.5-7.5的范围内放置24h还能保持50％以上的酶活;在60℃-70。C间表现出最大酶活,在60℃下保温4h,酶液仍保持86.5％的初始酶活;化学修饰实验结果表明Trp可能是菊糖果糖转移酶催化过程中的关键氨基酸;金属离子、EDTA、SDS等物质对该酶酶活影响不大,说明此酶是非金属离子结合酶;该酶Km为0.52mM,最大反应速度为0.3μMDFAⅢ/mL·min;该酶最小作用底物为蔗果四糖(GF3);其N-端氨基酸残基序列依次为AEGAKASPLNSPNVYDVT。根据N-端氨基酸序列比对结果结合酶学性质,可判定A.aurescensSK8.001菊糖果糖转移酶是产双果糖酐Ⅲ型菊糖果糖转移酶家族的新成员。
通过体外PCR扩增获得并成功克隆该菊糖果糖转移酶的基因,该基因全长为1353bp,编码450个氨基酸,该基因提交到GenBank数据库,数据库登记号为:HM138085。为研究信号肽对E.coliBL21(DE3)表达菊糖果糖转移酶的影响,根据菊糖果糖转移酶的基因结构,构建了三个表达系统:BL21(pET22b-ift-W)、BL21(pET22b-ift-P)、BL21(pET22b-ift-In),分别带有原菊糖果糖转移酶信号肽、pelB信号肽、不带信号肽的胞内表达。对比其胞内、胞外产酶状况,三个工程菌均表达活性菊糖果糖转移酶,其中BL21(pET22b-ift-W)是一个成功的分泌表达系统。研究了分泌表达工程菌E.coliBL21(pET22b-ift-W)发酵过程,胞内酶活最高值出现在12h处,达到119U/mL;胞外酶在72h时达到酶活顶点,酶活为81.0U/mL,是原野生菌培养基优化后酶活的4.1倍。分离纯化重组蛋白,验证了其菊糖果糖转移酶活性,在pH6.0和55℃条件下表现最大酶活,在pH4.8的范围内4℃放置24h能保持70％的酶活,60℃下保温4h能保持81％的残余酶活。