老龄化是全世界面临的社会难题。据联合国经济和社会事务部统计,在2030年全世界将有约14亿60岁以上的老人。据统计,2019年中国65岁及以上人口为17603万人,占12.6%。正常老化伴随着认知功能的逐步下降。随着人类寿命的延长,越来越多的老年人出现了认知功能障碍。认知功能障碍的老人需要社会和家庭更多的经济和精力投入,但因机制目前尚不明确,也缺乏针对的防治措施。老化过程中MRI检查发现中枢神经系统脑白质呈现异常高信号。脑白质的异常高信号的严重程度随着年龄的增加而逐渐增加。而基于人口的横断面研究发现脑白质异常高信号与认知功能密切相关。在中枢神经系统(CNS)中,脑白质主要由髓鞘化的神经纤维构成。CNS的髓鞘形成细胞是少突胶质细胞,其发出的细胞膜反复包饶轴突形成髓鞘。少突胶质细胞(Oligdentrocyte,OL)由少突胶质细胞前体细胞(Oligdentrocyte precursor cells,OPCs)增殖分化产生。髓鞘不但可以保证动作电位快速而准确的传导,还可以为神经元提供营养支持以及调节突触发育。从出生后到成年有大量的髓鞘形成,文献报道在成年以后,OPCs持续增殖分化产生新的形成髓鞘。但是这些新形成髓鞘的是否参与调节神经功能?在老化过程中髓鞘形成有何变化?等问题均不清楚。为此我们围绕成年动物,尤其是老化过程中的髓鞘形成变化及其功能从以下四个方面来进行研究。(1)成年动物老化过程中的OPC、OL和髓鞘变化,以及小鼠的认知能力改变;(2)构建转基因荧光报告小鼠,细胞特异性标记新生髓鞘和追踪已形成髓鞘的转归情况;(3)采用OPCs特异性敲除Olig2小鼠模型(Cspg4-CreERT;Tau-mGFP;Olig2 fl/fl),模拟成年后髓鞘形成障碍,探究成年后髓鞘形成对认知功能的作用;(4)采用毒蕈碱型乙酰胆碱受体1(Muscarinic acetylcholine receptor 1,Chrm1)基因条件敲除或促髓鞘形成药物氯马斯丁(Clemastine)处理,观察促进髓鞘形成是否可以改善老化小鼠的认知功能。我们采用了免疫荧光染色和透射电镜观察老化过程中髓鞘的形态学变化,通过Morris水迷宫检测小鼠的学习和空间记忆能力。主要结果如下:1.老化过程中髓鞘丢失,且伴随显著的空间学习和记忆能力下降。我们通过免疫荧光染色观察了髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)和CC1阳性的OLs及Cspg4阳性的OPCs,发现随着年龄的增加,MBP的表达量和OLs数量明显减少;OPCs数量无明显变化。通过透射电镜观察3月龄、13月龄、17月龄和22月龄小鼠胼胝体区髓鞘,发现有髓神经纤维的密度随着年龄的增加而下降;通过统计胼胝体区域髓鞘的g-ratio,发现在老化过程中g-ratio总体呈上升趋势。我们用水迷宫来检测4月龄与13月龄小鼠的空间记忆能力是否有差异。发现13月龄小鼠在水迷宫平台象限所游时间明显少于4月龄,且13月龄小鼠在平台所在象限所游距离也明显短于4月龄。在水迷宫实验训练5天中,13月龄小鼠找到平台所需时间均大于4月龄。表明在老化过程中学习和记忆能力均明显下降。2.构建转基因荧光报告小鼠,标记新生髓鞘和追踪已形成髓鞘。采用Cspg4-CreERT;Tau-mGFP转基因小鼠标记新生髓鞘,统计新生髓鞘的数量,发现4月龄和6月龄小鼠在诱导2个月后胼胝体区新生髓鞘数量较多,18月龄和22月龄小鼠在胼胝体区、海马区域新生髓鞘显著减少。我们观察了4月龄、8月龄、13月龄Cspg4-CreERt;mT/mG小鼠在诱导10天后胼胝体区域OPCs和新生的OLs的变化。通过Cspg4免疫荧光染色,我们发现Cspg4阴性、mGFP阳性的OLs随着年龄的增加逐渐减少。为标记和追踪已形成髓鞘,构建PLP-CreERT;mT/m G小鼠,3月龄他莫昔芬诱导标记所有已形成髓鞘,发现13月龄小鼠的新生髓鞘较4月龄下降了约10%,表明在3月龄形成的大部分髓鞘在随后的10个月中保持稳定。3.髓鞘形成调节成年动物空间记忆能力。我们使用了Cspg4-CreERT;Tau-mGFP;Olig2 fl/fl转基因小鼠来特异性抑制髓鞘形成,荧光报告基因可以观察到新生髓鞘。在4月龄诱导后观察到特异性敲除Olig2小鼠在胼胝体皮层、海马新生髓鞘减少。特异性敲除Olig2没有影响到OLs(CC1阳性)、OPCs(Cspg4阳性)、及小胶质细胞(Iba1阳性)的数量。水迷宫试验显示,特异性敲除Olig2小鼠穿过平台次数明显少于对照组小鼠;在平台所在象限所游时间和距离也明显少于对照组小鼠。表明活跃的髓鞘形成是空间记忆所必须的。4.促进髓鞘形成可以改善老化导致的认知功能下降。我们想知道促进OPCs分化和髓鞘形成是否可以改善老年小鼠的记忆功能。我们采用Chrm1条件敲基因小鼠发现敲除组小鼠胼胝体、皮层及海马区域mGFP阳性的OLs和髓鞘是同龄对照组小鼠的5倍,并且血管和小胶质细胞未受明显影响,表明OPCs中特异性敲除Chrm1可以促进髓鞘形成。鉴于海马区突触减少与海马功能下降密切相关,我们观察了敲除组小鼠与对照组小鼠突触蛋白的表达,发现特异性敲除Chrm1小鼠突触前膜和突触后膜的突触小点密度明显增加。水迷宫试验显示敲除组小鼠穿过平台次数及在平台所游时间和距离均多于对照组小鼠。Clemastine药物处理12月龄小鼠4个月后,小鼠的髓鞘形成,学习和记忆能力得到了明显改善。以上试验结果表明促进髓鞘形成可以改善老年小鼠海马区的突触丢失及记忆功能。综上所述,我们的结果提示年龄相关的脑白质体积下降可能与髓鞘退化和更新能力下降有关。通过Olig2敲除模型证实了成年后髓鞘形成是维持学习记忆能力所必需的,提示老年小鼠记忆能力下降可能部分与髓鞘形成减少有关。接下来特异性敲除Chrm1受体和促进髓鞘形成药物能够改善学习和记忆能力且促进突触形成。以上研究证实了髓鞘形成对于认知功能的重要作用,同时为减缓老化过程中的神经功能下降提供治疗思路和策略。