铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种普遍存在于环境中的条件致病菌,同时也是研究革兰氏阴性菌群体感应、生物膜、毒力和耐药性的重要模式生物。传统的铜绿假单胞菌基因组编辑方法存在着操作繁琐,耗时费力等缺点。因此,在铜绿假单胞菌中开发通用可行的基因编辑工具将有助于铜绿假单胞菌的生物和生理基础研究。来源于细菌和古细菌内部免疫防御系统的CRISPR/Cas系统已经被改造为基因编辑工具并应用于多个物种中。其中新型CRISPR效应蛋白Cpf1和由它衍生而来的CRISPR/Cpf1编辑系统进一步扩大了基因编辑靶位点的选择范围,而且更加简单精准、脱靶率低,已广泛引起人们的关注。本研究首先证明了来源于土拉热弗朗西丝菌(Francisella novicida)的FnCpf1蛋白在铜绿假单胞菌PAO1中具有高剪切活性,同时也发现PAO1内源性的非末端同源连接相关蛋白和重组酶活性较弱,不足以修复由FnCpf1造成的DNA双链断裂。基于此,本研究构建了一套可在PAO1菌株进行高效基因编辑的CRISPR/Cpf1双质粒(pCpf1-λRed和pCrRNA)系统,其中pCpf1-λRed质粒包含组成型表达的FnCpf1蛋白和诱导型表达的外源性噬菌体λ-Red重组酶;pCrRNA质粒包含组成型表达的crRNAs,编辑模板和同源臂以及用于质粒清除的sacB基因。在基因删除方面,此系统对绿脓素生成和毒力相关基因phzM(1,013bp)以及膜蛋白相关基因oprM(1,461bp)和mexA(1,178bp)的删除效率为75-100%;在基因插入和替换方面,此系统对外源报告蛋白rfp(783bp)和lacZ(3,149bp)的替换效率在67-100%,插入效率在75-100%。在DNA大片段的删除方面,本研究利用串联两个crRNA的策略成功实现了绿脓素生成相关基因簇phzMS(9.4kb)和mexHphzS(14.8kb)的删除,删除效率均为75%;继而,通过pCrRNA系列质粒的清除与轮换,成功实现了绿脓素生成相关基因簇phzA1G1(6.4kb)和phzA2G2(6.5kb)的连续删除。最后,生长曲线测试表明,编辑后的突变菌株的生长速率与野生型PAO1菌株无明显差异;菌落颜色实验表明,当与绿脓素生成相关的基因和基因簇被删除后,除了ΔphzA2G2突变体无特别明显的绿脓素减少外,其他5个突变体的绿脓素产量均下降。本研究在铜绿假单胞菌中成功建立了一套基于CRISPR/Cpf1系统的基因编辑技术,扩充了CRISPR/Cas系统在铜绿假单胞菌中的应用,对于铜绿假单胞菌的生物和生理基础研究具有重要意义。