拟南芥线粒体HSP60/HSP10分子伴侣的组成与功能的初步分析

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植物作为固着的有机体,会受到各种生物与非生物的胁迫,这些胁迫会造成蛋白质稳态的破坏,从而对植株的生长和繁殖造成影响。伴侣蛋白可以帮助多种底物蛋白进行折叠与组装,使蛋白质形成正确的空间结构来行使功能,它有I型伴侣蛋白和II型伴侣蛋白两种类型,线粒体分子伴侣HSP60/HSP10属于I型伴侣蛋白。在拟南芥中HSP60有三种蛋白亚基,分别为HSP60-2、HSP60-3A和HSP60-3B;以及存在两个辅助伴侣蛋白HSP10-1和HSP10-2。目前对于HSP60/HSP10功能的研究在哺乳动物体内相对较多,它们在机体参与免疫反应这一方面发挥着非常重要的作用,但是在植物体内的研究还相对较少,其作用的底物和工作机制还不清楚。因此,为了探究植物线粒体HSP60/HSP10的组成和功能,本课题鉴定了HSP60/HSP10各亚基蛋白相应的突变体,并对它们产生的表型进行初步的观察分析。主要研究结果如下:(1)本研究从ABRC突变体库获得了hsp10-1、hsp10-2、hsp60-2、hsp60-3a和hsp60-3b五种纯合突变体,与野生型相比,hsp10-1纯合突变体表现生长缓慢,莲座叶数目减少,根短,晚抽薹以及在生殖方面缺陷的表型;hsp10-2、hsp60-2、hsp60-3a和hsp60-3b纯合突变体没有明显的表型变化。(2)通过杂交实验获得了hsp60-2hsp60-3a和hsp60-3ahsp60-3b的纯合双重突变体,与野生型相比,hsp60-2hsp60-3a没有明显的表型变化,hsp60-3ahsp60-3b表现生长缓慢,根短以及晚抽薹的表型变化,hsp60-2hsp60-3b表现致死的表型变化,结合进化树及相对表达量结果表明在拟南芥中HSP60-3B在基因功能上处于主导地位,其次是HSP60-2,最后是HSP60-3A。在hsp10-1与hsp10-2杂交实验中只找到了基因型为AAbb、Aa Bb和aa BB的植株,正反交实验表明杂合Aa Bb的植株只产生Ab和a B两种非交叉型配子,不产生AB和ab交换型配子,很可能是配子发生过程中交叉互换被阻止了,从而得不到其余的基因型植株。(3)通过转基因互补实验使hsp10-1纯合突变体表型恢复至野生型水平,表明hsp10-1纯合突变体产生的表型确实是由HSP10-1这个基因造成的;并且通过亚细胞定位和GUS染色,发现HSP10-1、HSP10-2都定位于线粒体,并且在植物体的根、茎、叶、花以及幼苗中都有表达;hsp10-1、hsp10-2、hsp60-2、hsp60-3a、hsp60-3b、hsp60-2hsp60-3a、hsp60-3ahsp60-3b纯合突变体相对于野生型超氧阴离子的含量分别增加了6、1.1、1.1、1.3、2、2、3.5倍。(4)对hsp10-1纯合突变体进行RNA-seq分析,共得到1079个差异基因,与野生型植株相比,上调的有786个,下调的有293个,这些基因主要参与转录调控,蛋白折叠,氧化磷酸化,对外界刺激的响应(缺氧、缺水、氧化、盐、伤害)和激素信号传导(乙烯、脱落酸、生长素、水杨酸、油菜素类固醇、赤霉素、茉莉素)途径;在i TRAQ数据分析中,共得到1459个差异蛋白,与野生型植株相比,上调的有688个,下调的有771个,这些蛋白主要富集在RNA代谢过程,蛋白折叠,蛋白磷酸化,氧化磷酸化,对外界刺激的响应(伤害、缺氧、缺水、氧化、盐、热)和激素信号传导(脱落酸、分裂素、油菜素类固醇、水杨酸)。综上所述,共伴侣蛋白HSP10-1在这些途径中具有非常重要的作用。
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