小穗,作为禾本科所特有的也是最后一级花序结构,其上着生的小花数直接决定着籽粒的数量,因此,小穗的发育对禾本科粮食作物的每穗粒数至关重要。相较于其他禾本科的作物,水稻等稻族物种的小穗又发育出了其独特的结构。近30年来,围绕水稻小穗及花器官发育的分子机制研究成为分子生物学的热点,对花的起始,花序的发育,花器官发育及形态的研究已初成体系,相对来说,对于小穗发育机制的研究才刚刚开始,有许多问题需要解答,这就需要更多的水稻小穗发育相关的突变体被鉴定,获得相关基因,深入的研究基因功能和作用机制,从而扩展和深入水稻花/穗发育的分子网络的构建,并为相关的水稻分子育种工作提供理论依据。在前面的研究中,我们鉴定了两个与水稻小穗及花器官特征发育密切相关的基因NONSTOP GLUMES 1(NSG1)和STAMLESS 1(SL1),两个基因均编码植物中特有的QALGGH型C2H2单锌指蛋白转录因子。通过对单个基因的突变体进行表型分析,基因进化分析及表达分析,初步确定了NSG1基因影响小穗副护颖和护颖等侧器官特征发育的功能及SL1基因影响小花浆片和雄蕊等内轮花器官特征发育的功能。本论文中,我们通过遗传学、细胞学和分子生物学等手段,进一步揭示了NSG1基因和SL1基因编码的C2H2锌指蛋白转录因子调控水稻花/穗器官特征发育的深入分子机制,为“三花小穗”分子设计育种途径及水稻花器官特征基因调控网络构建提供了新的基因资源,主要结论如下:1.NSG1基因调控水稻小穗发育的分子机制研究水稻的小穗,作为其特有的花序结构,是决定水稻品质和产量的重要因素之一。正常水稻一个小穗内小花数目恒定——包含一个可育小花(由外稃、内稃、浆片、雄蕊和雌蕊组成)。1937年提出的“三花小穗”假说认为原始的水稻小穗可能由三个小花构成:小穗基部两个“无用”的颖片器官——护颖可能是两个侧生小花外稃的退化遗迹,而内部的花器官已完全消失。我们曾经在2017年深度解析了LF1基因诱导侧生小花发生的分子机制,鉴定了一个功能获得性突变体lf1,发现两个护颖腋下起始形成了新的花器官(内稃、浆片、雄蕊和雌蕊),为“三花小穗”假说提供了直接证据。但是,想要最终恢复原始“三花小穗”,仍有一些问题需要解决,比如退化的护颖需要恢复成外稃,以便和内稃一起包裹保护内部的花器官或籽粒。先前的研究中,我们发现了一个副护颖和护颖伸长呈外稃状的突变体nsg1,表型分析及表达分析发现,NSG1编码的C2H2型锌指蛋白转录因子的功能缺失会造成突变体小穗多个器官向外稃状器官的转变,相关小穗特征发育基因的表达发生改变,本研究中,通过利用多种遗传学,细胞学及分子生物学手段,对NSG1调控侧生器官特征发育的分子机制进行了深入的探究,主要结论如下:1.1 NSG1基因调控副护颖与护颖的特征发育在NSG1的3个等位突变体中,副护颖和护颖出现不同程度的伸长和变宽,大部分副护颖和小部分下位护颖被转化为内稃边缘状器官,更多的上下位护颖则被转化为外稃状器官。这表明NSG1基因参与调控水稻小穗副护颖与护颖的特征发育。1.2 NSG1基因调控内稃和浆片的特征发育本研究中,在nsg1突变体中,出现外稃状的内稃,内稃边缘在不同程度上获得了外稃的特性,浆片被拉长和/或加宽,并获得与内稃边缘或外稃相似的特性。NSG1基因的缺失造成了内稃边缘和浆片的同源异形转化,暗示NSG1基因参与调控水稻小穗内稃和浆片的特征发育。1.3 NSG1基因通过调控LHS1、MFO1、DL和G1的表达维持小穗侧生器官特征本研究中,除雌蕊和外稃外,nsg1小穗中所有器官的特性都发生了改变,并在不同程度上转化为外稃/内稃边缘状器官。在nsg1小穗中,LHS1、DL和MFO1均在两个或两个以上的器官中异位表达,包括副护颖、护颖、内稃、浆片和雄蕊,而G1在副护颖和护颖中表达减少。进一步证实NSG1蛋白可以与LHS1启动子区结合,与水稻共抑制因子Os TRP相互作用,然后招募HDACs介导靶基因的组蛋白乙酰化水平,抑制其表达。2.SL1基因调控水稻花器官发育的分子机制研究花器官发育的研究一直是分子生物学研究的热点。过去的三十年间,在拟南芥中已经建立了一个成熟的花器官特征基因调控网络(FOS-GRN)。然而,在水稻和其他禾本科植物中其调控网络仍然未知。先前的研究中发现SL1基因编码一个C2H2型锌指蛋白,突变体的表型与水稻B功能基因SPW1的功能缺失突变体spw1十分相似,即2、3轮花器官浆片和雄蕊向1、4轮稃片和雌蕊的同源异形转化,通过表达模式分析发现DL基因的表达扩展到了第3轮,SPW1基因的表达被显著抑制。推测由于SL1基因功能的缺失导致DL基因的异位表达和SPW1基因表达的降低,从而引起和spw1突变体类似的雄蕊雌蕊化的表型。在本研究中,通过对sl1、spw1和dl突变体之间的表型观察、基因表达模式分析和遗传互作分析,我们发现SL1可以通过与染色体重塑复合物(如Os Ruv B1)相关的一些共同调节因子形成复合物,通过组蛋白修饰和/或其他染色质状态调整直接激活SPW1的表达,并激活其他B功能基因共同抑制雌蕊特征基因DL的异位表达,以确保水稻小花浆片和雄蕊的正常发育,主要结论如下:2.1 SL1正向激活SPW1的表达,而不是对DL抑制通过更为深入的表型和表达分析发现,在sl1突变体中,SPW1在浆片和雄蕊原基中表达微弱。当DL基因同时丧失功能时,SPW1在sl1+dl双突变体的第2轮和第3轮的表达仍然非常微弱,与在sl1单突变体中观察到的情况类似。这表明,SPW1在sl1突变体中的低水平表达不是由于DL的异位表达引起,而是由于SL1活性的丧失。因此,SL1可以正向激活SPW1的表达,而不是对DL行使抑制。2.2 SL1能与SPW1的启动子结合SL1可以正向激活SPW1的表达,我们运用Ch IP-q PCR分析和双荧光素酶报告法检测了SL1与SPW1启动子结合的潜在位点及其激活SPW1表达的能力。。实验结果证实SL1可以通过与SPW1启动子结合直接调控SPW1的表达。2.3 SL1能与染色质重塑复合物Tip60(含Os Ruv B1、Os DP1/E2F和Os Tip60蛋白)结合,介导SPW1基因的组蛋白修饰由于SL1作为转录因子不具有明显的激活活性,为了深入探究SL1激活SPW1的分子机制,我们运用Co-IP和酵母点对点筛选出两个染色质重塑复合体相关蛋白,Os Ruv B1和Os DP。Os Ruv B1是染色质重塑复合物Tip60/Ino80/Swr的重要组成蛋白,而Os DP则可以通过E2F蛋白募集Tip60复合体参与众多生理过程。Tip60染色质重塑复合体可以调控组蛋白H4的乙酰化水平,sl1突变体中H4K5ac和H4K8ac水平均显著降低,以上结果暗示SL1能与Tip60(含Os Ruv B1、Os DP1/E2F和Os Tip60蛋白)互作,提高SPW1基因的组蛋白乙酰化水平激活其表达。