背景肥厚型心肌病是一类以左心室和／或右心室肥厚为主要特征的可遗传的心肌疾病,是诱发猝死、心力衰竭和中风的重要危险因素之一。现阶段,关于肥厚型心肌病的分子病理生理的基础研究仍较少,确定参与肥厚型心肌病病理发生发展的重要修饰基因对开展肥厚型心肌病新的治疗方法至关重要。Tomoregulin-1是新近发现的一个生长因子,主要参与胚胎中后期发育的调控和成体中枢神经系统正常功能的维持,在多种中枢神经系统疾病中表达异常。Tomoregulin-1在心脏组织中亦表达,并能够和参与心脏发育的Cripto相结合。本实验室基因芯片结果发现,Tomoregulin-1在遗传性肥厚型心肌病cTnTR92Q转基因小鼠的心脏组织中表达增高。但目前尚无有关Tomoregulin-1在心脏中的功能,尤其是在肥厚型心肌病中的功能研究。因此,本文旨在通过建立Tomoregulin-1沉默和Tomoregulin-1过表达转基因小鼠,分析Tomoregulin-1对肥厚型心肌病的调节作用及可能的分子机制。方法(1) Tomoregulin-1于野生型和肥厚型心肌病小鼠心脏组织中的定位和表达：免疫荧光观察Tomoregulin-1于野生型C57BL/6J小鼠心脏组织中的定位；Western blot检测Tomoregulin-1于野生型C57BL/6J小鼠心脏组织中的时程表达变化和Tomoregulin-1于遗传性肥厚型心肌病(cTnTR92Q转基因小鼠)及压力负荷致肥厚型心肌病(主动脉缩窄,thoracic aorta constriction, TAC)小鼠心脏组织中的表达变化。(2)心脏组织特异Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1过表达转基因C57BL/6J小鼠的建立：分别将靶向Tomoregulin-1基因的siRNA和鼠源Tomoregulin-1基因插入α-MHC启动子下游,构建表达载体,通过显微注射法建立心脏组织特异Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1过表达转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1过表达转基因小鼠的基因型,Western blot检测Tomoregulin-1的表达,分别筛选Tomoregulin-1沉默和Tomoregulin-1过表达转基因首建鼠进行繁殖培育,稳定传代后,子代小鼠用于本文实验。(3)正常生理情况下,心脏组织特异Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1过表达转基因C57BL/6J小鼠心脏形态和功能的表型分析：M型超声心动图于1、3、5和7月龄检测同窝阴性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1过表达转基因小鼠正常生理情况下心脏的结构形态和功能。(4)压力负荷刺激情况下,心脏组织特异Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1过表达转基因C57BL/6J小鼠的表型分析与分子机制探究：于8-10周龄,分别对同窝阴性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1过表达转基因小鼠进行TAC,同时设假手术对照组(sham组)。于术后4周,记录sham和TAC组中同窝阴性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1过表达转基因小鼠的生存状况,M型超声心动图检测小鼠心脏的结构形态和功能变化,计算心脏重量与体重的比值评价心肌肥厚程度,病理组织学染色观察小鼠心脏组织学改变,实时定量PCR检测反映心肌间质胶原成分的Ⅲ型胶原αl (Col3α1)的表达变化。Western blot检测sham和TAC组中同窝阴性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1过表达转基因小鼠心脏组织中包括转化生长因子2型受体(TGFβ type 2 receptor,TβR2)、转化生长因子1型受体(TGFβ type 1 receptor, TβR2)、转化生长因子激活激酶1(TGFβ-activated kinase 1, TAK1)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)等与心肌肥厚相关的因子的表达变化。结果(1)Tomoregulin-1定位于野生型小鼠的心肌细胞而非心脏成纤维细胞。随着年龄的增加,Tomoregulin-1在野生型小鼠心脏组织中表达水平逐渐增高；且在遗传性(cTnTR92Q转基因小鼠)及压力负荷(TAC)致肥厚型心肌病小鼠模型心脏组织中表达增高。(2)分别建立了2个系的心脏组织特异的Tomoregulin-1低表达沉默小鼠和Tomoregulin-1高表达转基因小鼠。(3)正常生理情况下,M型超声心动图显示,与同窝阴性小鼠相比,心脏组织特异Tomoregulin-1沉默小鼠在1、3、5和7月龄时心脏均呈现室壁变薄,心腔增大,心收缩功能减退的表型：心脏组织特异Tomoregulin-1过表达转基因小鼠在5月龄之前心脏均呈现室壁增厚,心腔缩小,心收缩功能增强的表型,在5月龄之后,与同窝阴性小鼠相比,Tomoregulin-1过表达转基因小鼠心脏室壁增厚不明显。(4)压力负荷刺激情况下,生存率分析显示,sham组的同窝阴性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1过表达转基因小鼠的生存率均为100%；TAC组,与同窝阴性小鼠相比,Tomoregulin-1沉默小鼠的术后4周生存率显著降低,仅为66.7%,而Tomoregulin-1过表达转基因小鼠的生存率为84.6%,显著高于同窝阴性小鼠。M型超声心动图显示,Tomoregulin-1沉默小鼠因压力负荷致心脏室壁增厚程度显著高于同窝阴性小鼠,而Tomoregulin-1过表达转基因小鼠心脏室壁增厚得到明显改善。同时,因代偿增加的心收缩功能亦显著低于同窝阴性小鼠。与同窝阴性小鼠相比,Tomoregulin-1沉默小鼠因压力负荷致心脏重量与体重的比值显著升高,而Tomoregulin-1过表达转基因小鼠心肌肥厚程度显著减少。病理组织学染色可见Tomoregulin-1沉默小鼠心肌细胞排列紊乱和间质纤维化程度均显著高于同窝阴性小鼠,而过表达Tomoregulin-1显著改善了压力负荷导致的病理组织学改变。反映心肌间质胶原成分的Col3α1在Tomoregulin-1沉默小鼠中的表达显著增加,Col3α1的病理性增加在Tomoregulin-1过表达转基因小鼠中得到抑制。与心肌肥厚相关的TβR1、TAK1和HNK在Tomoregulin-1沉默小鼠心脏组织中均被激活,且经过压力负荷病理刺激后,激活程度更加明显；而过表达Tomoregulin-1在生理和病理情况下均可显著抑制TβR1、TAK1和JNK的激活。结论 过表达Tomoregulin-1可显著改善压力负荷引起的心肌肥厚,降低Tomoregulin-1的表达可加速心肌肥厚的病理进程；心肌细胞中的TAK1-JNK信号通路参与Tomoregulin-1对压力负荷引起的心肌肥厚的保护性调节过程。Tomoregulin-1可能是肥厚型心肌病调节的重要修饰基因,为临床肥厚型心肌病的治疗提供新的研究思路和方向。背景随着人们生活水平的提高,物质条件的改善,全球肥胖的患病率和发生率迅速增加,肥胖已成为全球性流行病。肥胖能引起甚多疾病,如2型糖尿病、高胆固醇血症、高血压或心脏病,与死亡率的增加和平均寿命的减少直接相关。人类基因组计划的完成,大量与肥胖、糖尿病等疾病相关的基因陆续被人们发现,瘦素受体(leptin receptor, Lepr)便是其中之一。Lepr由糖尿病(diabetes, db)基因编码,于脉络丛中高表达。Lepr与其配体leptin结合启动调节摄食和机体的能量平衡。Lepr缺失或leptin缺失,均会导致肥胖的发生,并出现不同程度糖尿病临床表现。目前,已有多种Lepr基因相关的啮齿类动物模型应用于肥胖、糖尿病的研究,但现阶段的动物模型均存在一定的不足,如Lepr缺失的小鼠(dbldb小鼠,C57BL/6J背景)表现出一过性高血糖,Lepr缺失的大鼠(Zucker大鼠,fa/fa大鼠)葡萄糖耐受受损表型出现迟缓等,不能完全复制人类糖尿病的所有临床表现。所以,建立更理想的肥胖、糖尿病等代谢疾病的动物模型,对防治药物的研发具有重大的临床价值和社会意义。方法 利用常间回文重复序列丛集/常问回文重复系列丛集关联蛋白9技术(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9, CRISPR/Cas9)建立Lepr基因敲除大鼠：针对Lepr基因第四个外显子设计并合成两个寡聚核苷酸链,构建gRNA表达载体,将体外转录好的Cas9 mRNA(20ng/μl)和gRNA(每个gRNA10ng/μl)的混合物通过显微注射法注入Sprague Dawley (SD)大鼠受精卵中,共产生8只大鼠。PCR鉴定Lepr基因敲除大鼠的基因型,TA克隆、测序进一步检测确定Lepr敲除情况,Western blot检测LEPR的表达,筛选Lepr基因敲除首建鼠进行繁殖培育,稳定传代后,子代的大鼠用于本文实验。于1-8月龄分别检测雄性和雌性同窝阴性大鼠和Lepr基因敲除纯合子(Lepr-/-)大鼠体重、平均摄食量、空腹血糖和随机血糖。于2、4和8月龄分别对雄性和雌性同窝阴性大鼠和Lepr-/-大鼠进行腹腔葡萄糖耐受实验,同时测定葡萄糖刺激下的胰岛素水平。于2、4和8月龄分别对雄性和雌性同窝阴性大鼠和Lepr-/-大鼠进行血生化指标测定,测定指标为：甘油三酯、总胆固醇、高密度胆固醇和低密度胆固醇。病理组织学染色观察2、4和8月龄同窝阴性大鼠和Lepr-/-大鼠胰脏、肝脏、肾脏和脂肪组织的组织学改变。微型计算机断层扫描分析8月龄同窝阴性大鼠和Lepr-/-大鼠的股骨远端骨小梁结构和骨结构相关参数,如骨体积/全部组织体积、骨小梁的数量、骨小梁间隙、骨小梁硬度和骨密度。结果利用CRISPR/Cas9技术,通过显微注射法共产生8只大鼠。经PCR鉴定、TA克隆和测序分析后,筛选出Lepr基因敲除298个碱基、插入4个碱基的2号大鼠作为首建鼠进行繁殖培育。Western blot检测Lepr-/-大鼠肝脏中无LEPR表达。Lepr-/-大鼠于1月龄出现严重的早期肥胖,至8月龄时,雄性和雌性Lepr-/-大鼠的体重分别是同窝阴性大鼠的1.6倍和2.6倍；体重的增加伴随着摄食量的显著增加。雄性Lepr-/-大鼠于4月龄出现空腹血糖增高,并持续至8月龄；于2月龄出现随机血糖增高,于4月龄达到峰值,是同窝阴性大鼠随机血糖值的2.64倍；雌性Lepr-/-大鼠的空腹血糖和随机血糖值均近乎正常水平。雄性Lepr-/-大鼠于2月龄出现明显的葡萄糖耐受受损,随年龄增大,受损程度逐渐增加,直至8月龄；雌性Lepr-/-大鼠仅于4月龄出现明显的葡萄糖耐受受损。雄性和雌性Lepr-/-大鼠于2、4和8月龄均出现高胰岛素血症、高胆固醇血症等脂质代谢紊乱。病理组织学染色显示,与同窝阴性大鼠相比,Lepr-/-大鼠胰岛出现明显的空泡、肥大、纤维化和出血；严重的肝脏脂肪变性；脂肪细胞体积显著增大；肾小球基质扩张,部分肾小球硬化,肾小管扩张和再生。8月龄的Lepr-/-大鼠,与同窝阴性大鼠相比,其股骨远端的骨体积/全部组织体积显著减小,骨小梁数量显著减少,骨小梁间隙显著增加,骨密度显著减小。结论利用CRISPR/Cas9技术成功建立Lepr基因敲除大鼠,并表现出明显的肥胖、食欲过盛、血糖升高、葡萄糖耐受受损、高胰岛素血症、血脂异常和一系列糖尿病并发症如胰腺、肝脏和肾脏的病理损伤。该敲除大鼠克服了现阶段Lepr基因相关的啮齿类动物模型的不足,为肥胖和糖尿病相关防治药物的研发提供了更理想的动物模型。