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研究背景:HBV感染是全球主要公共卫生问题之一,目前仍有2.57亿慢性感染者。HBV感染很难被根治,但部分患者可实现功能性治愈。一方面,HBV感染者抗病毒治疗后,病毒复制可得到完全抑制,其中部分NAs经治患者再次接受IFN-α治疗后,HBsAg水平降低甚至检测不到,达到功能性治愈标准。另一方面,在儿童慢乙肝患者中,干扰素抗病毒治疗后不仅获得较高HBsAg转阴率,并且在年龄越小的患者中更易产生HBsAb。在HBV功能性治愈可实现的历史背景下,如何评价HBV功能性治愈变得尤为重要。目前临床中所用的HBV DNA和乙肝五项检测技术不能满足对功能性治愈的有效评判,其中抗病毒治疗患者的HBV DNA即使在检测不到的状态下,停药后病毒会反弹,说明HBV DNA不能用于判断HBV功能性治愈。HBeAg阴性患者的特殊情况是,在HBV患者中存在前核心突变,即使有HBV病毒也不表达HBeAg。另外,HBV DNA可以整合到宿主基因组中,可以持续表达HBsAg。即使已经实现功能性治愈,但HBsAg仍会表达,也不能作为HBV功能性治愈的标准。近年来,HBV pgRNA与HBcrAg用于监测肝内ccc DNA的数量和转录活性,预测停药后复发风险。HBcrAg包括HBcAg、HBeAg以及P22蛋白,其中HBeAg在血清浓度远高于HBcAg。因此HBcrAg不能在HBeAg阳性和阴性患者之间进行有效比较。HBcAg是病毒核壳蛋白,由pgRNA直接翻译得到,其表达不受抗病毒治疗药物直接影响。血清中HBcAg定量检测可在HBeAg阳性和阴性患者发挥评估作用,预测抗病毒治疗患者的治疗应答与停药后复发风险,有潜力作为一项HBV功能性治愈评价指标,因此开发HBcAg双抗体夹心ELISA法有重要临床意义。为获得高亲和力的抗体,我们选择制备兔源单克隆抗体,在原核表达了HBcAg,免疫新西兰兔得到了4株单克隆抗体。为了更好特异性识别HBcAg,我们合成HBcAg-C末端特异性多肽作为免疫原,免疫BALB/c小鼠得到了5株单克隆抗体,对所获抗体用ELISA与Western blot进行分析。随后利用生物素标记技术进一步提高单克隆抗体识别能力。选择特异性强的单克隆抗体进行配对组合初步建立HBcAg双抗体夹心ELISA法。研究目的1.筛选识别HBcAg的兔源单克隆细胞株;2.制备针对HBcAg-C末端特异序列的鼠源单克隆抗体;3.初步开发检测HBcAg双抗体夹心ELISA方法。研究方法在原核表达系统（BL21（DE3））菌表达HBc Ag重组蛋白,经镍柱亲和层析与source Q柱两步纯化得到HBcAg重组蛋白。以HBcAg重组蛋白作为免疫原,免疫4只新西兰兔,第3次免疫1周后,通过耳静脉采血,用间接ELISA方法检测兔抗血清效价。选免疫效价较高的实验兔,取脾细胞与240E-W2骨髓瘤细胞进行细胞融合,单细胞铺板。培养15天后收集细胞培养上清。对获得稳定阳性单克隆细胞株利用ELISA和Western blot分析结果。设计HBcAg-C末端特异性多肽序列并合成,以多肽作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,第3次免疫1周后,通过尾静脉采血,用间接ELISA方法检测鼠抗血清效价,选免疫效价较高的小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,单细胞铺板。培养10天后,收集细胞上清。对获得稳定阳性单克隆细胞株利用ELISA分析结果。采用小鼠体内诱生法获得腹水并纯化得到抗体。研究结果1.重组HBcAg蛋白表达在BL21（DE3）菌表达HBcAg,诱导表达产物在21KDa出现清晰条带,说明重组蛋白HBcAg表达成功,纯化后经SDS-PAGE,使用His-tag抗体western blot证明纯化得到重组HBcAg。2.兔抗血清效价采取免疫前实验兔血清（作为阴性对照）与免疫后血清,以1:1000开始稀释,2倍梯度稀释免疫后兔抗血清,通过ELISA方法分析结果可得4只免疫新西兰兔效价均可达1:512000,其中4号免疫兔效价最高。3.细胞融合筛选结果选择高效价免疫兔脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,收集细胞上清,通过间接ELSIA法进行检测,第一轮初步筛选450块96孔板,结果显示有90株OD 450nm值≥0.5,后经再次确认筛选,获得了7株稳定阳性克隆细胞株。4.HBcAg兔单克隆细胞株特异性鉴定以0.4μg/ml重组HBcAg（rHBcAg）为包被抗原,检测上述所得7株抗HBcAg单克隆抗体,稀释至4000倍OD450nm值均>0.5,说明7株抗体均可有效识别rHBcAg;其中#1、#3单克隆抗体稀释至16000倍OD450nm值仍>0.5,且阴性对照OD450nm值<0.1,说明这两株与rHBcAg结合活性更强。随后,Western blot分析结果显示,以真核细胞表达的HBcAg为抗原,#5、#6、#7、#8单克隆抗体在21 KDa位置检测到条带;以重组HBcAg蛋白为检测抗原,#1、#3、#5、#7单克隆抗体可在21 KDa位置检测到清晰条带。5.抗体序列比对分析将获得7株兔源单克隆细胞株经测序分析,结果显示其中4株单克隆细胞株重链V区序列一致。6.抗HBcAg-C端鼠源单克隆抗体间接ELISA检测合成HBcAg-C端特异性多肽免疫小鼠,制备了5株单克隆抗体。以0.3μg/ml HBcAg-C端多肽-1为包被抗原,2号鼠单抗在稀释16000倍（0.625μg/ml）条件下,OD450nm值为0.179,说明2号鼠单抗可有效识别HBcAg-C端多肽-1。以0.3μg/ml HBcAg-C端多肽-2为包被抗原,5号鼠单抗稀释至相同倍数OD450nm值为0.292,说明5号鼠单抗可有效识别HBcAg-C端多肽-2。以10μg/ml rHBcAg为包被抗原,0.625μg/ml 2号鼠单抗为一抗,OD450nm值为0.236,说明2号鼠单抗与rHBcAg有良好识别活性。7.评价生物素标记抗HBcAg-C端鼠源单克隆抗体识别效果为提高检测灵敏度,对2号鼠单抗进行生物素标记,以10μg/ml rHBcAg为包被抗原,50μg/ml生物素标记的2号鼠单抗作为一抗,OD450nm值接近2.0,说明生物素标记2号鼠单抗与rHBcAg有较强的结合活性。8.检测HBcAg的双抗体夹心ELISA法初步摸索尝试包被不同株兔多抗/兔单抗,与二抗生物素标记2号鼠单抗进行组合,建立双抗体夹心ELISA法检测rHBcAg。以兔多抗为包被抗体,浓度从1:100梯度稀释至1:2500,检测不同浓度rHBcAg,2μg/ml生物素标记2号鼠单抗作为识别抗体,结果显示,检测3.2 ng/ml rHBcAg,OD450nm值在0.2～0.5,阴性对照值均<0.15,说明此组合可有效识别rHBcAg。结论1.在大肠杆菌表达系统中,成功表达并纯化得到全长HBcAg重组蛋白。2.免疫新西兰兔,兔抗HBcAg血清效价均达到很高水平,表明免疫策略是成功的。随后利用杂交瘤技术获得了4株兔抗rHBcAg单克隆抗体,均对rHBcAg有良好识别活性。3.免疫小鼠,利用杂交瘤技术获得了5株鼠抗HBcAg特异性C端单克隆抗体,2号鼠单抗对HBcAg-C端多肽-1和rHBcAg有良好识别活性,5号鼠单抗对HBcAg-C端多肽-2有良好识别活性。随后利用生物素标记的2号鼠单抗也对rHBcAg具有较好的结合活性。研究目的表达并纯化兔源单克隆抗体,用于建立检测HBcAg的双抗体夹心ELISA方法。研究方法通过常规酶切连接方式将所得4株单克隆抗体DNA克隆连接至pcDNA3.0载体上,构建真核表达质粒。在293T细胞中转染重组表达质粒,收集细胞培养上清并利用protein A进行抗体纯化,用ELISA法确证抗体,并选择其中两株兔源单克隆抗体进行生物素标记以提高检测的灵敏度。将所得兔源单克隆抗体与鼠源单克隆抗体进行配对组合,建立检测HBc Ag的双抗体夹心ELISA方法。研究结果1.经酶切琼脂糖凝胶电泳与测序确证,成功构建4株单克隆抗体的表达质粒。将重链表达质粒与轻链表达质粒共同转染至293T细胞,转染后收集细胞上清利用protein A纯化经考马斯亮蓝染色分析显示4株重组抗体均可成功表达。2.以2μg/ml#1和#5兔单抗混合液为包被抗体,10μg/ml生物素标记2号鼠单抗为识别抗体,在检测不同rHBcAg浓度条件下OD450nm值均<0.4,阴性对照OD450nm值为0.20～0.25。相同包被情况下,0.5μg/ml生物素标记#3和#7兔单抗混合液为二抗,检测40 ng/ml rHBcAg OD450nm值为0.13,阴性对照OD450nm值<0.05,说明此组合可检测到rHBcAg最低浓度为40 ng/ml。结论1.成功构建可大量表达兔单抗的真核表达系统,得到的兔单抗均与rHBcAg有很强结合活性。2.初步建立了一种基于兔单克隆抗体检测HBcAg的双抗体夹心ELISA法,检测rHBcAg达到ng数量级别。