Ⅰ型干扰素是抗病毒先天免疫系统的重要成员。当病毒入侵宿主时,相应的模式识别受体会识别其病原相关分子模式,进而激活下游Ⅰ型干扰素信号通路来抵御病毒。凋亡是细胞程序性死亡的一种方式,能够与Ⅰ型干扰素相互辅助来完成抗病毒反应。RNASEK是一种核糖核酸酶,存在于所有后生动物,广泛表达于所有组织和发育阶段,物种保守性高。此外,有研究显示RNASEK是多种病毒摄入所必需的。LY6E作为一种干扰素诱导因子,受RNASEK调控来完成病毒摄入的过程。RNASEK还参与到多种肿瘤的发生发展。例如,在紫杉醇诱导肿瘤细胞凋亡过程中RNASEK显著上调。这些研究暗示RNASEK可能参与了抗病毒先天免疫和凋亡。然而,RNASEK对Ⅰ型干扰素和凋亡的调控,尚未报道。草鱼是我国传统的四大淡水养殖鱼类之一,草鱼呼肠孤病毒或小RNA病毒引起的病毒性出血病流行广泛,导致草鱼死亡率高达70%-80%。研究草鱼的先天免疫可以为防治病毒性疾病提供直接依据。草鱼的先天免疫系统与哺乳动物相似性较高,作为免疫学研究的模型,也逐渐受到重视。因此,本研究以草鱼为模型探索RNASEK对Ⅰ型干扰素和凋亡的调控及机制。我们首先对草鱼旁系同源基因RNASEK-a和-b进行了同源克隆。RNASEK-a和-b的开放阅读框大小分别为966 bp和1180 bp,均包含3个外显子,并且两基因外显子大小相同。它们的CDS大小均为306 bp,蛋白序列同源性高达73.27%。系统进化树显示RNASEK在各物种间具有较高保守性,暗示其可能具有重要的生物学功能。为了观察草鱼RNASEK-a和-b的细胞分布,我们进行了亚细胞定位实验。结果显示草鱼RNASEK-a和-b仅定位于细胞质,进一步精细定位发现两者主要位于早期内体（endosome）、晚期内体和内质网,而很少定位于线粒体和溶酶体。为了观察RNASEK-a和-b是否会响应病毒刺激,我们用poly I:C（ds RNA）和草鱼呼肠孤病毒刺激草鱼个体和肾细胞,然后利用实时定量PCR检测两基因的转录水平。结果发现两种刺激源均可在体内体外上调RNASEK-a和-b表达,暗示它们参与了先天免疫应答。为了验证这个假设,我们在草鱼肾和卵巢的体外培养细胞中过表达或敲低RNASEK-a或-b,然后分别采用实时定量PCR和蛋白质免疫印迹/免疫荧光染色检测Ⅰ型干扰素的转录水平和蛋白表达。结果表明,过表达RNASEK-a和-b均可上调Ⅰ型干扰素的m RNA和蛋白,而敲低RNASEK-a和-b均能下调Ⅰ型干扰素的m RNA和蛋白,说明RNASEK-a和-b均能通过促进Ⅰ型干扰素表达来启动先天免疫。前人研究证明草鱼IRF3/IRF7磷酸化激活可诱导Ⅰ型干扰素产生。为了证明RNASEK-a和-b是否会通过IRF3/IRF7来促进Ⅰ型干扰素,我们在草鱼肾细胞中过表达RNASEK-a和-b,发现IRF3和IRF7的磷酸化水平均显著上调,说明草鱼RNASEK-a和-b可以通过磷酸化激活IRF3和IRF7来诱导Ⅰ型干扰素表达。鉴于凋亡的重要性及与先天免疫的密切联系,我们进一步研究草鱼RNASEK-a和-b对凋亡的调控。我们在草鱼肝细胞、肾细胞和卵巢细胞中过表达RNASEK-a或-b,然后采用Bax/Bcl-2 m RNA比值、DNA Ladder、TUNEL染色或流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果表明,过表达RNASEK-a和-b均可以上调Bax/Bcl-2 m RNA比值、增加DNA断裂、提高TUNEL阳性细胞比例,以及增加Annexin V阳性细胞比例,说明RNASEK-a和b均能够促进细胞凋亡。本实验室前期证明草鱼e IF2α磷酸化激活可以促进细胞凋亡。为了证明草鱼RNASEK-a和-b是否通过e IF2α来发挥促凋亡作用,我们在草鱼肾细胞和肝细胞中过表达RNASEK-a或-b,发现两者均可磷酸化激活e IF2α,说明它们通过磷酸化e IF2α来促进细胞凋亡。综上所述,RNASEK的物种保守性较高,在鱼类中存在两个成员,即旁系同源蛋白RNASEK-a和-b。草鱼RNASEK-a和-b定位于细胞质（主要定位于细胞内体和内质网）,且广泛表达于几乎各个组织。Poly I:C（ds RNA）和草鱼呼长孤病毒在草鱼细胞和组织中均可上调RNASEK-a和-b表达。更有趣的是,草鱼RNASEK-a和-b能够促进IRF3/IRF7磷酸化介导的Ⅰ型干扰素表达和e IF2α磷酸化介导的细胞凋亡。总之,本研究首次揭示RNASEK是Ⅰ型干扰素和凋亡的一个新的正向调控因子,从而为进一步完善先天免疫和凋亡信号通路提供了理论依据,为防治相关疾病提供了新靶点和新思路。