论文部分内容阅读
目的:通过体内实验探讨半夏泻心汤对荷瘤昆明小鼠S180的抑制作用及其作用机制;并通过体外实验探讨半夏泻心汤大鼠含药血清对人胃癌BGC-823细胞的增殖抑制作用及其机制,进而探讨其用于胃癌治疗的可行性。方法:1动物实验:选择雄性清洁级昆明小鼠50只,将经小鼠腹腔传代的S180细胞,调整浓度至1×107个/ml,取细胞悬液0.2ml,接种于小鼠右上肢腋部皮下。于接种次日将其随机分成5组:空白对照组、半夏泻心汤低剂量组(1g/ml)、半夏泻心汤中剂量组(2g/ml)、半夏泻心汤高剂量组(3g/ml)及环磷酰胺组,每组10只。空白对照组灌服生理盐水,各中药组分别灌服三个不同剂量的半夏泻心汤,0.15ml/10g.d每日灌药1次,共14天,环磷酰胺组给予环磷酰胺0.3mg/(10g.d),隔日腹腔注射1次,共7次。于第15天将所有小鼠称重后处死,立即剥瘤、取脾、称重,计算肿瘤抑制率及脾指数。同时取瘤组织,用免疫组化法分析VEGF、Bcl-2蛋白表达情况。应用流式细胞仪测定细胞周期及凋亡并定量分析VEGF、Bcl-2蛋白表达的变化。2体外实验:按“通法”制备低剂量(0.77g/ml)、中剂量(1.54g/ml)、高剂量(3.08g/ml)半夏泻心汤大鼠含药血清。然后选择人胃癌细胞系BGC-823细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测低、中、高三组半夏泻心汤大鼠含药血清、不同时间组(24h、48h、96h)对BGC-823细胞增殖的影响。应用免疫细胞化学(immunocytochemistry)方法分析半夏泻心汤大鼠含药血清作用BGC-823细胞48h后VEGF、Bcl-2蛋白表达的变化。流式细胞术测定不同剂量组半夏泻心汤大鼠含药血清对人胃癌BGC-823细胞作用48h后的细胞周期分布及细胞凋亡的影响。应用流式细胞仪间接免疫荧光技术分析不同剂量组半夏泻心汤大鼠含药血清作用于BGC-823细胞48h后VEGF、Bcl-2蛋白表达的变化。结果:1动物实验(1)于给药结束后次日处死5组S180荷瘤小鼠,称量各组的瘤重及脾重,分别计算各组的抑瘤率及脾指数。低、中、高中药组和环磷酰组的抑瘤率依次22.2%、45.9%、57.8%、73.0%,三个中药组的抑瘤率随半夏泻心汤剂量的增大逐渐增加。空白对照组、低、中、高中药组和环磷酰组的脾指数依次为8.183、8.380、8.986、9.798、8.380,高剂量中药组的脾指数与空白对照组比较明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)免疫细胞化学检测结果显示:空白对照组细胞中VEGF、Bcl-2染色均为阳性,细胞的胞浆或胞膜中可见棕黄色着色。各中药组中VEGF及Bcl-2在细胞中的染色强度明显减弱,而环磷酰胺组细胞中的VEGF、Bcl-2染色仍为阳性。(3)流式细胞术检测结果显示:对细胞周期的分析结果显示:低、中、高半夏泻心汤组与对照组相比,G0/G1期细胞逐渐增多,S期和G2/M期细胞则逐渐减少,提示半夏泻心汤可阻滞细胞周期于G0/G1期,且该作用具有剂量依赖性。瘤组织经流式细胞术检测凋亡率结果显示:空白对照组、中药低、中、高三组及环磷酰胺组的凋亡百分率依次为2.52%、15.92%、23.05%、28.54%、31.34%。不同剂量中药组和环磷酰胺组均出现典型的亚二倍体凋亡峰,且各中药组随半夏泻心汤剂量的增大凋亡率逐渐升高。中药各组、环磷酰胺组的凋亡率分别与空白对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪间接分析细胞VEGF、Bcl-2的蛋白表达显示:空白对照组、中药低、中、高三组及环磷酰胺组细胞中VEGF的荧光指数FI值依次为2.783、2.219、2.025、1.368和2.449。空白对照组、中药低、中、高三组及环磷酰胺组细胞中Bcl-2的荧光指数FI值依次为2.166、1.822、1.639、1.232和1.984。低、中、高中药组和环磷酰胺组细胞中VEGF、Bcl-2的荧光指数FI值均较对照组减小,对于每种蛋白,分别比较各中药组、环磷酰胺组与空白对照组的FI值,差异具有统计学意义(P<0.05)。2体外实验(1)MTT比色法结果显示:低、中、高剂量半夏泻心汤大鼠含药血清对BGC-823细胞均具有增殖抑制作用。不同剂量组的半夏泻心汤含药血清处理细胞24~96h后,与对照组比较,各中药组OD比值均有不同程度的下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。且随半夏泻心汤含药血清剂量的增大、作用时间的延长,OD比值逐渐下降,即半夏泻心汤含药血清对BGC-823细胞的增殖抑制作用有明显的剂量依赖性和时间依赖性,且抑制率以高剂量半夏泻心汤含药血清作用72h为最高,可达52.9%。(2)免疫细胞化学检测结果显示:未经半夏泻心汤含药血清处理的BGC-823细胞中VEGF、Bcl-2染色均为阳性,细胞的胞浆或胞膜中可见棕黄色着色。而经三个剂量组的半夏泻心汤含药血清处理48h后的细胞中, VEGF及Bcl-2的染色强度均减弱。(3)流式细胞术检测结果显示:低、中、高剂量组半夏泻心汤大鼠含药血清作用BGC-823细胞48h后,随剂量的增大,G0/G1期细胞逐渐增多,S期和G2/M期细胞则逐渐减少。提示半夏泻心汤可阻滞BGC-823细胞周期于G0/G1期,该作用呈剂量依赖性。正常对照组、空白对照组、低、中、高剂量半夏泻心汤含药血清作用BGC-823细胞48h后各组的凋亡百分率依次为1.31%、1.66%、7.66%、13.16%和23.24%。低、中、高剂量组半夏泻心汤含药血清处理BGC-823细胞48h后,均出现典型的亚二倍体凋亡峰,且随半夏泻心汤剂量的加大而逐渐升高。各中药组的凋亡率与空白对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪间接分析BGC-823细胞中VEGF、Bcl-2的蛋白表达结果显示:正常对照组、空白对照组和中药低、中、高半夏泻心汤组BGC-823细胞中VEGF的荧光指数FI值依次为3.231、3.326、2.966、2.798和2.631。正常对照组、空白对照组和中药低、中、高半夏泻心汤组BGC-823细胞中Bcl-2的荧光指数FI值依次为3.268、3.471、3.136、3.083和2.801。不同剂量半夏泻心汤含药血清作用BGC-823细胞48h后,VEGF、Bcl-2的荧光指数FI值随药物剂量的增大而逐渐降低。对于每种蛋白,分别比较各中药组和空白对照组的FI值,差异具有统计学意义(P<0.05),且以高剂量组的FI值降低最为明显。结论:1半夏泻心汤在一定剂量范围内,可抑制小鼠S180肿瘤的生长并呈一定的剂量依赖性。高剂量的半夏泻心汤可提高荷瘤小鼠的脾指数,提示半夏泻心汤可提高荷瘤小鼠的免疫力及抗肿瘤能力。2半夏泻心汤在一定剂量范围内,能够抑制BGC-823细胞增殖,并呈一定的剂量和时间依赖性。3半夏泻心汤可将小鼠S180细胞和BGC-823细胞阻滞于周期G0/G1期,并可诱导这两种细胞凋亡,该作用呈一定的剂量依赖性。4半夏泻心汤可下调VEGF和Bcl-2蛋白的表达,提示其可能通过抗血管生成、抑制细胞增殖、诱导凋亡而发挥抗肿瘤作用。5本研究为半夏泻心汤在抗小鼠S180肉瘤、抗胃癌中的应用提供了理论依据。6本研究可能为中医“辨证论治”思想,在分子水平的体现,提供了一定的理论支持。