论文部分内容阅读
结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是人类最常见的癌症之一,随着我国生活水平的提高,饮食结构的改变,结直肠癌的发病率迅速增长,经济发达地区发病率已接近西方发达国家(居恶性肿瘤第二位)。结直肠癌的发生呈现出从正常组织,经过息肉、腺瘤、高级别瘤变等病变缓慢发展至癌的漫长过程。在此过程中,肿瘤细胞突破机体的免疫清除及免疫平衡阶段发展至肿瘤,从而逃避机体的免疫监视,肿瘤微环境中免疫细胞的浸润、免疫因子的产生及其与肿瘤细胞的相互作用,发挥了极其重要的作用,而T细胞介导的免疫应答是抗肿瘤免疫的基础,因此,T细胞在肿瘤微环境中的浸润和功能决定了机体对肿瘤免疫监视的结果。T细胞的有效活化和功能介导需要双重信号的协同作用：一是抗原肽—MHC复合物,由T细胞抗原受体(TCR)识别；二是共刺激信号,由抗原提呈细胞(APC)用于介导和／或调节T细胞应答的B7家族共刺激分子和其他共刺激分子提供。业已表明肿瘤微环境负性共刺激分子的表达,参与肿瘤免疫逃逸过程,是构成肿瘤微环境的重要因素。近年发现的B7家族的一系列新成员在肿瘤中异常表达,是介导肿瘤免疫逃逸的关键因子,因此,B7家族负性共刺激分子成为肿瘤免疫领域研究的热点。B7家族分子的主要成员有B7-1、B7-2、B7-D、B7-H1、B7-H2、B7-H3和B7-H4。这些共刺激分子不仅提供促进T细胞增殖、分化和分泌细胞因子的正性信号,同时还通过提供负性信号来限制、终止和／或减弱T细胞免疫应答。B7-H1、B7-H3和B7-H4是相继发现的3个主要的负性B7家族新成员,它们分别与表达在活化T细胞的受体相互作用,介导负性信号调节T细胞的活化和增殖。这3种负性共刺激分子的mRNA和蛋白表达方面表现出高度相似性,即mRNA均广泛表达于肠、胃、肺和肾等多种非淋巴组织,而蛋白在这些正常外周组织中不表达,但异常表达在多种恶性肿瘤组织,如胃癌、肺癌、肾细胞癌和前列腺癌等。既往研究主要分析负性B7家族中某一个分子在肿瘤特定阶段表达,而在肿瘤发展演进不同阶段的表达规律至今尚待解决,此外这些分子在肿瘤微环境中表达受何种因素调节也待探讨。B7-H1、B7-H3和B7-H4在肿瘤细胞和免疫细胞上的表达均受到微环境细胞因子调节,与不同阶段肿瘤微环境改变有关,可能各自具体的调控机制各不相同,也可能存在相互作用的网络。鉴此,本论文分析了结直肠癌发生、发展相应阶段微环境中B7-H1、B7-H3或B7-H4的表达规律、表达细胞和表达部位,继而对其可能的调节机制作初步探讨。本研究对阐明这些负性共刺激分子在结直肠癌不同阶段表达对肿瘤免疫逃逸的作用机制具有重要的价值,为结直肠癌的早期诊断及靶向治疗,提供新的干预策略。第一部分负性共刺激分子B7-H1、B7-H3、B7-H4在结直肠癌演变过程中的表达模式[目的]检测人结直肠癌演变过程中各阶段病变组织中共刺激分子B7-H1、B7-H3、B7-H4的表达,探讨其在结直肠癌演变不同阶段中的表达模式。[方法]收集结直肠癌演变过程中的各阶段病变组织,包括息肉、腺瘤、高级别瘤变和肠癌组织。其中肠癌手术切除的组织98例、息肉30例、腺瘤30例、高级别瘤变25例；分别通过免疫组织化学染色方法及激光共聚焦显微镜,分析B7-H1、B7-H3、B7-H4分子在结直肠各阶段病变组织中的表达模式,探讨其表达的潜在价值。[结果]免疫组化结果显示,30例息肉、30例腺瘤、25例高级别瘤变及98例结直肠癌组织中B7-H1、B7-H3、B7-H4分子的表达。结果发现：(1)B7-H1、B7-H3分子在息肉、腺瘤及高级别瘤变阶段均发现表达,并在癌组织中大量表达；(2)B7-H4分子仅在癌组织中表达,B7-H1、B7-H3分子在息肉阶段以核表达为主,B7-H3分子同时存在胞浆及胞膜表达,而B7-H4分子不表达；(3)B7-H1、B7-H3分子在腺瘤阶段以核表达为主,同时表达于浸润淋巴细胞,而B7-H4分子不表达；(4)B7-H1、B7-H3分子在高级别瘤变阶段以胞浆及胞膜表达为主,B7-H1、B7-H3和B7-H4分子在肿瘤阶段以胞浆及胞膜表达为主,同时也存在核表达。[结论]共刺激分子B7-H1、B7-H3在结直肠演变早期阶段即表达,是B7家族负性分子中最早参与结直肠癌事件发生的分子,提示B7-H1、B7-H3分子参与了结直肠癌演变的整个过程并发挥重要的作用,而B7-H4仅在结直肠癌组织中表达,同时不同的表达模式可能存在其不同的临床意义。第二部分负性共刺激分子B7-H1、B7-H3、B7-H4在结直肠癌中表达的临床意义[目的]检测人结直肠癌组织中共刺激分子B7-H1、B7-H3、B7-H4的表达,分析其表达与结直肠癌临床病理因素及患者生存时间的关系,探讨B7-H1、B7-H3.B7-H4表达的临床意义；研究结直肠癌微环境中浸润CD3+、CD8+、CD68+细胞与预后的关系。[方法]收集结直肠癌组织98例,免疫组织化学染色方法,分析B7-H1、B7-H3、B7-H4分子分别在结直肠癌癌灶及间质组织中的表达,结合患者的临床病理资料及生存时间,统计学分析其表达的临床意义；免疫组织化学染色方法分析结直肠癌98例肿瘤组织中浸润CD3+、CD8+、CD68+细胞与预后的关系。[结果]免疫组化分析结果显示：(1)B7-H1分子在结直肠癌在癌灶中的表达水平与患者的分化程度相关,B7-H3分子在结直肠癌在间质淋巴细胞上的表达水平与患者的淋巴结转移相关,B7-H4分子在结直肠癌间质淋巴细胞上的表达水平与患者的年龄、淋巴结转移、是否粘液腺癌相关；(2)在癌灶中的表达水平与患者的肿瘤分期、淋巴结转移、远处转移、Dukes’分期相关；(3)生存分析显示B7-H1、B7-H4分子在结直肠癌表达水平与肠癌患者生存率的相关,B7-H3表达水平与肠癌患者生存率的相关性无显著统计学意义；(4)B7-H1、B7-H3、B7-H4分子在结直肠癌中的共表达和患者预后的关系发现：92.9%的结直肠癌患者不同程度的表达B7家族负性共刺激分子,且预后与共表达B7家族负性共刺激分子的水平呈负相关。(5)结直肠癌肿瘤CD3+T淋巴细胞浸润数量与患者生存呈正相关。[结论]共刺激分子B7-H1、B7-H3、B7-H4在结直肠癌组织中异常高表达,并与结直肠癌的临床病理因素和生存密切相关。B7-H1、B7-H3、B7-H4分子在结直肠癌中共表达的水平与患者生存呈负相关。结直肠癌肿瘤CD3+T淋巴细胞浸润数量与患者生存呈正相关,是免疫逃逸阶段抑制细胞免疫应答的重要机制。第三部分miRNA对负性共刺激分子B7-H1、B7-H3、B7-H4在结直肠癌演变过程中表达的调节作用[目的]检测分析结直肠癌和癌旁miRNA表达的差异,探讨B7-H1、B7-H3、B7-H4分子表达的可能调节机制。[方法]收集6对结直肠癌新鲜组织样本,包括癌和癌旁组织(距癌组织边缘2cm); Affymetrix miRNA芯片检测分析结直肠癌和癌旁组织miRNA表达的差异,并采用生物信息学软件niRanda (http://microma.org/)对可能与B7-H1、B7-H3和B7-H4结合的miRNA进行预测。[结果]经Affymetrix miRNA芯片检测,发现30条癌组织比癌旁组织表达显著升高的miRNA,8条癌组织比癌旁组织表达显著降低的miRNA,并采用生物信息学软件miRanda (http://microma.org/)对可能与B7-H1、B7-H3和B7-H4结合的niRNA进行了预测,其中,miR-195(B7-H1)、miR-625(B7-H3)和miR-498(B7-H4)的表达均与肠癌的发展相关。[结论] miR-195(B7-H1)、miR-625(B7-H3)和miR-498(B7-H4)的表达均与肠癌的发展相关,提示结直肠癌不同阶段,B7-H1、B7-H3和B7-H4的异常表达可能受到表达变化的miRNA调节。综上所述,本课题通过分析共刺激分子B7-H1、B7-H3、B7-H4分子在结直肠癌演变过程中的表达及其临床意义,探讨B7-H1、B7-H3、B7-H4分子在肿瘤微环境中参与肿瘤免疫逃逸的可能作用及调控机制,为寻找结直肠癌早期诊断的肿瘤标志物及有效的肠癌干预靶向分子提供新的理论基础,具有原创性和重要的临床应用价值。